平板间误差率?
平板间菌落数平均差?100%
平板间菌落平均数平板间菌落数平均差?
(平板间菌落平均数?各平板菌落数)的绝对值之和
平板数平板间菌落平均数?
各平板菌落数之和
平板数稀释度间菌落数误差率?
稀释度间菌落数平均差?100%
稀释度间菌落平均数稀释度间菌落平均差?
(稀释度间菌落平均数?各稀释度菌落数)的绝对值之和
稀释度数稀释度间菌落平均数?
2.1.3.5 注意事项
各稀释度平均菌落数之和
稀释度数（1）严格无菌操作，防止污染。
（2）认真检查实验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。
（3）注意菌液的均匀分散。 （4）取液要准确，尽量减少误差。
（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管或吸头。 （6）样液加入平皿后应尽快倾注培养基，避免样液干燥。 （7）倾注时培养基温度不得超过45℃，以防损伤细菌或真菌。
（8）倾注和摇动应尽量平稳，勿使培养基外溢，确保细菌分散均匀，便于计数菌落。 2.1.4 残留消毒剂（化学因子）的去除方法 2.1.4.1 目 的
对于消毒剂的消毒效果试验，在达到规定的消毒时间时，要求立即终止其继续作用，以便准确检测出试验体系中仍然存活的微生物及其数量。本方法可去除残留消毒剂对微生物的杀灭和抑制作用。
2.1.4.2 去除残留消毒剂方法的原则要求
（1）应有效去除残留的消毒剂。
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（2）对试验微生物无害，不减少其回收量。 （3）不破坏培养基的营养成份，不影响其透明度。 2.1.4.3 去除残留消毒剂的方法
（1）稀释中和法（又称中和剂法）
指在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续杀灭和抑制微生物的方法。其操作要点如下：
1）将经消毒剂作用过的微生物样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中。
2）所用中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同。 3）即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测。
4）在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。
（2）过滤冲洗法
将经消毒剂作用过的微生物样本，立即加入适量稀释液中混匀（通过适量稀释，可减轻消毒剂的持续作用），并倾入装有微孔滤膜的滤器内，接真空泵抽吸过滤（或加压过滤）后，再加适量稀释液冲洗，同时过滤，可去除残留的消毒剂。多用于难以找到适宜中和剂的消毒效果试验。本方法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。其操作要点如下：
1）准备好微孔滤膜、滤器。滤膜及滤器需先经灭菌处理。
2）初次过滤后，应使用一定量对微生物无害的稀释液进行冲洗，冲洗次数一般以洗净消毒剂为准。
3）最后一次冲洗、滤净后，将微孔滤膜以无菌操作法取出，进行随后的培养检测。 2.1.4.4 注意事项
（1）处理时应严守无菌操作要求，所有试液须灭菌，接触样本和试液的器材均须无菌。 （2）每次吸液，均须更换一支无菌吸管，以防交叉污染。
（3）所用吸管的容量应尽量与拟吸取的液体量相近，不要用大吸管吸取少量液体。 （4）试验条件可影响残留消毒剂的去除效果，故每进行一种消毒效果试验，均需按规定对所选方法进行去除效果的鉴定试验。 2.1.5 中和剂鉴定试验 2.1.5.1 目 的
确定所选中和剂是否适用于拟进行的消毒效果鉴定试验。 2.1.5.2 实验器材
（1）实验菌菌悬液和菌片（见 2.1.2） （2）刻度吸管（1.0mL、5.0mL） （3）平皿
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（4）恒温水浴箱 （5）稀释液 见附录A （6）培养基 见附录A （7）电动混匀器 2.1.5.3 试验设计原则
（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用，对试验用微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响。
（2）试验中所用消毒剂的浓度应为杀菌试验中使用的最高浓度。
（3） 同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验。对细菌繁殖体，在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌中任选其一进行试验；对细菌芽孢、白色念珠菌、黑曲霉菌、分枝杆菌应分别进行鉴定试验。
当用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验。 （4） 鉴定时根据所用杀菌试验方法，相应使用悬液或载体进行试验。 2.1.5.4 实验分组
在细菌与真菌杀灭试验中所用除药方法的鉴定，至少应平行进行以下各组试验。 第 1 组 中和剂 + 菌悬液 → 培养
第 2 组 （消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培养 第 3 组 稀释液 + 菌悬液 → 培养
第 4 组 稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养 2.1.5.5 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序
根据实验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。将菌悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释成 2.5310cfu/mL～1.5310cfu/mL，作为试验菌悬液。鉴定试验包括4组：
第 1 组 取 0.4mL 标准硬水于试管内，加入 4.5mL 中和剂，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再加入 0.1mL 试验菌悬液，混匀，作用 10min，分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
第 2 组 取 0.4mL 消毒剂于试管内，加入 4.5mL 中和剂（对于酸性氧化电位水检测时，取 0.5mL 消毒剂于试管内，加入 4.4mL 中和剂） 混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再加入 0.1mL 试验菌悬液，混匀，作用 10min，分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
第 3 组 取 0.4mL 标准硬水于试管内，加入 4.5mL 稀释液，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再加入 0.1mL 试验菌悬液，混匀，作用 10min，分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
第 4 组 分别吸取稀释液、标准硬水与中和剂各 0.5mL 于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基 15mL～20mL，培养观察。
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3
4
2.1.5.6 中和剂载体定量鉴定试验操作程序
根据实验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。将适宜浓度的菌悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释作为试验菌悬液，载体试验用菌量应保证其回收菌量在 2.5310cfu/片～1.5310cfu/片之间。鉴定试验包括4组：
第 1 组 吸取中和剂 5.0mL 于无菌平皿中，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和剂内，作用 10min。 立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0mL 中和剂试管中，用电动混匀器混合20s，或将试管振打 80次，混匀，分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
第 2 组 吸取中和产物溶液（按每片浸有消毒剂的载体加入含 5.0mL 中和剂的量制备中和产物） 5.0mL 于无菌平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和产物溶液中。作用 10min，用无菌镊子取出菌片，移入含 5.0mL 中和产物溶液的试管中，用电动混匀器混合20s，或将试管振打 80次，混匀。分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
第 3 组 吸取稀释液 5.0mL 于无菌平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后， 用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于稀释液中。作用 10min，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0mL 稀释液的试管中，用电动混匀器混合20s，或将试管振打 80次，混匀 ，分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
第 4 组 分别吸取稀释液与中和剂各 1.0mL 于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基 15mL～20mL，培养观察。 2.1.5.7 评价规定
实验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格：
（1）第 1、2和 3 组有相似量试验菌生长，悬液试验作用体系中菌量在50cfu/mL～300cfu/mL之间，载体试验菌量在 2.5310cfu/片～1.5310cfu/片 之间。其组间菌落数误差率应不超过 15%。第1、2和 3 组间菌落数误差率计算公式如下：
2
3
2
3
（三组间菌落平均数?各组菌落平均数）的绝对值之和组间菌落数误差率??100%
三组菌落平均数之和
（2）第4组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应更换无污染的试剂重新进行试验。 （3）试验重复 3 次，每次试验均应符合以上要求。 2.1.5.8 注意事项
（1）试验所分各组均有其特定意义，不得任意删减。
（2）严守无菌操作，保持试验用液和器材的无菌，注意更换吸管，以防止沾染影响试验的
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准确性。
（3）实验组序应按本规范所列排列。 2.1.6 过滤冲洗法去除残留消毒剂试验 2.1.6.1 目 的
通过滤膜过滤和冲洗的方法，去除试验体系中的残留消毒剂，以便准确检测出试验体系中仍然存活的微生物及其数量。本方法可去除残留消毒剂对微生物的杀灭和抑制作用。 2.1.6.2 实验器材
（1）过滤设备 包括灭菌处理的滤器、微孔滤膜（孔径为0.45μm），真空泵（或抽滤泵） （2）稀释液和冲洗液 应不影响滤膜的性质，对微生物无伤害作用。可用生理盐水、PBS、稀释液（见附录A）、0.5%吐温80的PBS、可中和部分消毒成分的中和剂
（3）其他器材随试验微生物确定 2.1.6.3 试验设计原则
（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所选方法是否对测试消毒剂有良好的去除作用，对试验微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响。
（2）试验中所用消毒剂的浓度应为杀菌试验中使用的最高浓度。
（3） 同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验。对细菌繁殖体，在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌中任选其一进行试验；对细菌芽孢、白色念珠菌、黑曲霉菌、分枝杆菌应分别进行鉴定试验。
当用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验。 （4）鉴定中应根据正式杀灭试验的设计，选择使用悬液定量试验，还是载体定量试验。通常，悬液鉴定试验结果可用于载体试验。 2.1.6.4 过滤冲洗去除方法的鉴定
操作程序如下：
根据实验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。将菌悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释成 2.5310cfu/mL～1.0310cfu/mL，作为试验菌悬液。其试验分以下3组进行：
第 1 组 吸取 1.0mL 试验菌悬液于试管内，加入 4.0mL 标准硬水，混匀。取 1.0mL 加入到过滤器中，然后加入 50mL 蒸馏水作冲洗过滤处理，然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，放置在 37℃ 恒温培养箱中培养 48h（真菌和芽孢培养72h），计数菌落数。
第 2 组 吸取 0.2mL 试验菌悬液直接加入到过滤器中，然后加入 150mL 至 500mL 冲洗液于过滤器中，做第 1 次冲洗过滤处理，再加入 50mL 蒸馏水做第 2 次冲洗过滤处理，最后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，放置在 37℃ 恒温培养箱中培养 48h（真菌和芽孢培养72h），计数菌落数。
第 3 组 吸取 4.0mL 消毒剂于试管中，加入 0.5mL 有机干扰物，再加入 0.5mL 稀释液，混匀，取 1.0mL 加入到过滤器中，加入 150mL 至 500mL 冲洗液做第1次冲洗过滤处理，再加入
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消毒技术规范（2008年版）
