50mL 冲洗液做第 2 次冲洗过滤处理，冲洗后吸取 0.2mL 试验菌悬液直接加入到过滤器中，再加入 50mL 蒸馏水做第 3 次冲洗过滤处理，然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置 37℃ 恒温培养箱中培养 48h（真菌和芽孢培养72h），计数菌落数。 2.1.6.5 评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
（1）第 1、2 和3 组测定的结果，菌悬液菌数应在 50cfu/滤膜～200cfu/滤膜之间，其组间菌落数误差率不得超过 15%。组间菌落数误差率的计算见2.1.5.7中公式。
（2）试验重复 3 次，每次试验均应符合以上要求。 2.1.7 细菌杀灭试验 2.1.7.1 目 的
在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢的消毒效果。 2.1.7.2 实验器材
（1）按 2.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。对特定用途或试验特殊需要，可准备相应其他菌种的悬液或菌片
（2）消毒剂溶液除有特殊规定者外，应使用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如，含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准，碘伏以所含有效碘为准，过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准，复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分含量为准。各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算，应以实验菌与消毒剂的混合液中有效成份的最终浓度（作用浓度）为准
（3）去除残留消毒剂的中和剂或设备（经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材） （4）消毒剂稀释用标准硬水 见附录A
（5）有机干扰物质 悬液试验和载体试验用牛血清白蛋白溶液，本规范中规定对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂，有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为0.3%；对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂，有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为3.0%。有机干扰物的配置方法见附录A
（6）TSA培养基 见附录A
（7）含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（中和剂TSB），中和剂经鉴定合格 （8）刻度吸管 （1.0mL、5.0mL） （9）恒温水浴箱 （10）恒温培养箱 （11）电动混匀器 （12）秒表 2.1.7.3 实验分组
试验中应分以下各组：
（1）试验组 按测试目的有两种选择。
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第一种适用于消毒产品鉴定。根据使用说明书，选定试验菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及 3个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的0.5倍，指定最短作用时间的 1.5倍。如说明书指定最短作用时间为 20min，则 3个作用时间应分别为 10min、20min和30min）进行试验。
第二种适用于消毒产品监督机构日常监测。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及1个作用时间（说明书指定最短作用时间）进行试验。
（2）阳性对照组 根据各种试验的规定，用标准硬水代替消毒剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表试验体系中的菌液浓度，以其作为对照组活菌浓度。 2.1.7.4 悬液定量杀菌试验操作程序
（1）按照2.1.2 配制实验用菌悬液，使其浓度为 1310cfu/mL～5310cfu/mL（回收菌落数为 1310cfu/mL～5310cfu/mL）。
（2）按照产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200mg/L，则应配制的浓度为250mg/L），置20℃±1℃ 水浴备用。
（3）取消毒试验用无菌试管，先加入 0.5mL 试验用菌悬液，再加入 0.5mL 有机干扰物质，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0mL 注入其中，迅速混匀并立即计时。
（4）待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取 0.5mL 试验菌与消毒剂混合液加于 4.5mL 中和剂中，混匀。
（5）各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0mL 样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2 个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。
（6）同时用标准硬水代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。
（7）所有试验样本均在 37℃ 恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（8）试验重复 3 次，计算各组的活菌浓度（cfu/mL），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值：
杀灭对数值 （KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－实验组活菌浓度对数值（Nx） 计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。但是，如果消毒实验组消毒处理后平均生长菌落数小于 1 时，本规范规定此时的杀灭对数值，即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值（KL≥No）。
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2.1.7.5 载体浸泡杀菌试验操作程序
（1）载体浸泡定量杀菌试验操作程序
1）按照2.1.2.4 制配实验用菌片，使每个菌片的回收菌数为 1310cfu/片～5310cfu/片。 2）取无菌平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0mL 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。
3）将盛有消毒剂平皿置 20℃±1℃ 水浴 5min，用无菌镊子取预先制备的菌片 3 片分别放入平皿中，并使之浸没于消毒液。
4）待菌液与消毒剂相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中。用电动混匀器混合20s，或将试管在手掌上振打 80次，中和作用 10min。混匀后，吸取 1.0mL 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，测定存活菌数。
5）另取一平皿，注入 10.0mL 稀释液代替消毒液，放入 2 片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。
6）所有试验样本均在 37℃ 恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
7）试验重复 3 次，计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值：
杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌量的对数值（No）－实验组活菌量对数值（Nx） （2）载体浸泡定性灭菌试验操作程序
1）按照2.1.2.4制配实验用菌片，使每个菌片的回收菌落数为1310cfu/片～5310cfu/片。 2）取无菌平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0mL 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。
3）将盛有消毒剂平皿置20℃±1℃水浴5min，用无菌镊子取预先制备的菌片 6 片分别放入平皿中，并使之浸没于消毒液。
4）待试验菌与消毒液相互作用至预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中。用电动混匀器混合20s，作为试验组样本。
5）另取一平皿，注入 20.0mL 标准硬水代替消毒液，放入 4 片菌片，作用至设定时间，取出 2 片，分别移入含 5mL 中和剂试管中，其随后的试验步骤与上述试验组相同，作为阳性对照组样本。另取出 2 片，分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中，用电动混匀器混合20s，或将试管在手掌上振打 80次，然后用稀释液做系列10倍稀释，选择适宜稀释度，吸取 1.0mL 接种平皿，每管接种 2 个平皿，做活菌培养计数，作为菌数对照组样本。
6）所有试验样本均在 37℃ 恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养 48h，观察最终结果；对细菌芽孢需培养 7d，观察最终结果。
7）试验重复5次，计算各组的活菌量（cfu/片）。
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2.1.7.6 流动浸泡载体定量杀灭试验操作程序
（1）按照 2.1.2.4 制备实验用菌片，使每个菌片的回收菌落数为 1310cfu/片～5310cfu/片。
（2）开启消毒设备，待产生的酸性氧化电位水或臭氧水中有效成分处于稳定状态时，进行杀灭试验。
（3）取尼龙网片或不锈钢网片放 250mL 烧杯底部中央，将染菌载体放于尼龙网片或不锈钢网片表面，染菌载体上再盖一尼龙网片或不锈钢网片。将酸性氧化电位水或臭氧水通过管路沿烧杯壁流下，流动浸泡消毒至规定作用时间，用无菌镊子将染菌载体取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中。用电动混匀器混合20s，或将试管在手掌上振打 80次，中和作用 10min。混匀，吸取 1.0mL 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，作为试验组样本。
（4）另取两个染菌载体放入 250mL 烧杯中，放置方法与试验组相同。以自来水代替酸性氧化电位水或臭氧水，在相同流量下流动浸泡至最长作用时间，其余步骤与试验组相同，作为阳性对照组样本。
（5）分别吸取稀释液与中和剂各 1.0mL 于同一无菌平皿内，倾入上述试验同批次的培养基15mL～20mL，作为阴性对照样本。
（6）所有试验样本均在 37℃（黑曲霉菌在30℃）恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果；对真菌和细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（7）试验重复 3 次，计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按 2.1.7.5（1）7）公式计算杀灭对数值。 2.1.7.7 滤膜过滤悬液定量杀灭试验
（1）菌悬液的制备和定量杀灭试验同2.1.7.4（1）、（2）和（3）。 （2）滤膜孔径 0.45μm
（3）待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取 1.0mL 试验菌与消毒剂混合液加入到过滤器中过滤，然后加入 150mL 至 500mL 冲洗液（预先置 20℃±1℃ 水浴中 5min）做第1次冲洗过滤处理，再加入 50mL 蒸馏水做第 2 次冲洗过滤处理，最后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置 37℃ 恒温培养箱中培养至规定时间。
（4）吸取 0.5mL 试验菌悬液于试管内，加入 0.5mL 有机干扰物，再加入 4.0mL 标准硬水，混匀。做系列10倍稀释后取适当稀释度该混合液 1.0mL 加入到过滤器中，然后加入 50mL 蒸馏水（预先置 20℃±1℃ 水浴中 5min）作冲洗过滤处理，然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置 37℃ 恒温培养箱中培养至规定时间，计数菌落数，作为阳性对照。
（5）分别吸取稀释液、蒸馏水和硬水各 1.0mL 于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基 15mL～20mL，置 37℃ 恒温培养箱中培养至规定时间，计数菌落数，作为阴性对照。
（6）试验重复 3 次，计算各组的活菌量（cfu/mL或片），并换算为对数值（N），然后按2.1.7.5（1）7）公式计算杀灭对数值。
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2.1.7.8 评价规定
（1）产品监督检验，在产品说明书指定的最低浓度与最短作用时间，重复试验3次。悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，判定为消毒合格。载体定量杀灭试验，各次的杀灭对数值均≥3.00，判定为消毒合格。
（2）产品申报卫生许可检验中，要求在产品说明书指定的浓度与3个作用时间，重复试验3次。在产品指定最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均≥5.00。载体定量杀灭试验和流动浸泡载体定量杀灭试验中，各次的杀灭对数均≥3.00，判定为消毒合格。在产品指定浓度与最短作用时间的0.5倍时，可允许对不同细菌或在部分重复次数中，出现不合格结果。
在申报卫生许可检验中，检验机构如果发现产品说明书指定的浓度与作用时间，与常规消毒剂量差异较大，不能进行消毒试验评价时，可根据专业知识合理调整其浓度与时间，然后再进行测试。
（3）对载体浸泡定性灭菌试验，阳性对照组有菌生长，菌数对照组符合要求，阴性对照组无菌生长，5次试验均无菌生长，判定为灭菌合格。
（4）报告中应将各次试验的结果全部以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次实验菌浓度，以及平均实验菌浓度。实验组应列出杀灭对数值，例如，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。 2.1.7.9 注意事项
（1）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。
（2）试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。
（3）悬液定量杀菌试验时，有机干扰物质一般采用3.0%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，在消毒体系中稀释10倍（含量为0.3%），进行消毒试验。如果某消毒剂使用说明书中指定，其产品只用于清洁物品或器械的消毒或只用于冲洗浸泡消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，在消毒体系中稀释10倍（含量为0.03%），进行消毒试验。 2.1.8 分枝杆菌杀灭试验 2.1.8.1 目 的
在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上分枝杆菌的消毒效果。 2.1.8.2 实验器材
（1）实验菌株 龟分枝杆菌脓肿亚种CA 93326（ATCC 19977） （2）培养基 分枝杆菌干燥培养基 （3）试验菌及其菌悬液或菌片的制备
（4）中和剂 （根据 2.1.5 所示方法鉴定合格者） （5）稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液
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消毒技术规范（2008年版）
