（6）消毒剂稀释用硬水 见附录A （7）有机干扰物质 见附录A
（8）刻度吸管 （0.1mL、1.0mL、5.0mL） （9）恒温水浴箱 （10）电动混匀器 （11）计时装置 （12）恒温培养箱
2.1.8.3 龟分枝杆菌脓肿亚种菌悬液的制备
（1）以无菌操作方式开启冻干菌种管，用毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0mL～10.0mL 营养肉汤试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃ 培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基平板上，置 37℃ 培养 72h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，置 37℃ 培养 72h，即为第 3代培养物。密封后，4℃ 保存，时间不得超过6周。
（2）试验时取第 3 代斜面培养物，在分枝杆菌干燥培养基斜面上连续传代，培养方法与第3代相同。取第5～6代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物（72h），用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL～5.0mL 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0mL 吸管将洗液移至另一含有 6g～7g 玻璃珠的无菌圆锥底塑料试管中，在电动混匀器混合 5min 然后将菌液吸入到另一试管内制成菌悬液。
（3）将制成的菌悬液，进行活菌培养计数（见 2.1.3），按其结果用稀释液稀释至所需浓度。
（4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用，当天使用不得过夜。 2.1.8.4 实验分组 试验分为下列各组：
（1）试验组，按 2.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间。
（2）阳性对照组，以标准硬水代替消毒剂溶液，按 2.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的活菌浓度，并以其计算消毒因子对受试菌的杀灭对数值。 （3）阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。 2.1.8.5 试验程序
常用杀灭试验有：悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验和流动浸泡载体定量杀菌试验等。其操作程序按 2.1.7.4、2.1.7.5 和2.1.7.6 进行，接种后的平皿应放入干净的塑料袋内，置 37℃ 恒温培养箱中培养 7d，观察最终结果。 2.1.8.6 评价规定
（1）产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次，悬液定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均≥4.00，载体定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均
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≥3.00，判定为消毒合格。
（2）产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次。
用悬液定量杀菌试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最低作用时间，以及最短作用时间的 1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，判定为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。
用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最短作用时间和最短作用时间的 1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。 2.1.8.7 注意事项
（1）分枝杆菌试验操作应在生物安全Ⅱ级实验室中进行，避免造成实验人员实验室感染和对环境污染。
（2）其它注意事项见 2.1.7.9。 2.1.9 真菌杀灭试验 2.1.9.1 目 的
在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子的消毒效果。 2.1.9.2实验器材
（1）麦芽浸膏琼脂（MEA） 见附录A （2）沙堡琼脂培养基 见附录A
（3）试验菌及其菌悬液或菌片 白色念珠菌ATCC 10231和黑曲霉菌ATCC 16404 孢子悬液与菌片，按 2.1.9.3（1）和 2.1.9.3（2）所示方法制备。根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选择相应的真菌或孢子悬液与菌片
（4）中和剂 （根据 2.1.5 所示方法鉴定合格者）
（5）磷酸盐缓冲液（ PBS，0.03 mol/L，pH7.2） （6）消毒剂稀释用硬水 见附录A （7）有机干扰物质 见附录A
（8）刻度吸管 （0.1mL、1.0mL、5.0mL）
（9）恒温水浴箱 （10）电动混匀器 （12）计时装置 （13）恒温培养箱 2.1.9.3 真菌悬液制备
（1）白色念珠菌悬液的制备
1）以无菌操作方式开启冻干菌种管，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于菌种管中，轻
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柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0mL～10.0mL 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃ 培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，置 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，置 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。
2）取第 3～6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL～5.0mL 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0mL 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混匀器混合20s，或在手掌上振打 80次，以使白色念珠菌悬浮均匀。
3）悬液定量杀菌试验时，实验用菌悬液的含菌量为 1310cfu/mL～5310cfu/mL；载体定量杀菌试验时，菌片制备按 2.1.2.4 要求进行。
4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用，当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。
（2）黑曲霉菌（ATCC 16404）孢子悬液或菌片的制备。
1）以无菌操作方式开启冻干菌种管，用毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含 5.0mL 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置 30℃±1℃ 恒温培养箱中培养 42h～48h。用接种环划线接种第 1 代培养物于 MEA 培养基平板，置 30℃±1℃ 恒温培养箱中培养 42h～48h。取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置 30℃±1℃ 恒温培养箱中培养 42h～48h，即为第 3 代培养物。
2）用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL～10.0mL 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置 30℃±1℃恒温培养箱中培养 42h～48h。
3）向罗氏瓶培养物中加入 5.0mL～10.0mL 0.05%（V/V）吐温 80 生理盐水溶液，刮洗黑曲霉菌分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇 1min 后，滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min～6000 r/min，离心 20min。再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。
4）黑曲霉菌分生孢子悬液在 2℃～8℃ 储存不能超过 2d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则不得使用。
5）悬液试验时，可用稀释液适当稀释使实验用菌悬液的含菌量为 1310cfu/mL ～5310cfu/mL。
6）制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10μl。染菌后，置二级生物安全柜内干燥备用。回收菌数应达 1310cfu/片～5310cfu/片。 2.1.9.4 实验分组
试验分为下列各组：
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6
6
7
7
7
7
（1）试验组，按 2.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间，对受试菌种的杀灭能力进行测定。
（2）阳性对照组，以标准硬水代替消毒剂溶液，按 2.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含试验菌的活菌浓度，并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值。
（3）阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。 2.1.9.5 试验程序
常用杀灭试验有：悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验等。对白色念珠菌使用沙堡琼脂培养基，对黑曲霉菌使用麦芽浸膏琼脂（MEA）。其操作程序详见 2.1.7。
活菌培养计数时，对白色念珠菌，在 37℃ 恒温培养箱中培养72h 观察最终结果。对黑曲霉菌，在30℃ 恒温培养箱中培养 72h 观察最终结果。 2.1.9.6 评价规定
（1）产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均≥4.00，判定为消毒合格。对所试特定真菌的杀灭对数值均≥4.00，判定为消毒合格。
（2）产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次，在产品规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的 1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品规定使用浓度与最短作用时间的 0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，判定为消毒合格。
用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的 1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品规定使用浓度与最短作用时间的 0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，判定为消毒合格。 2.1.9.7 注意事项
（1）黑曲霉菌试验操作应在专门的生物安全Ⅱ级实验室内进行，避免造成环境污染和操作者受污染。
（2）其它注意事项见 2.1.7.9。 2.1.10 病毒灭活试验 2.1.10.1 目 的
评价各种用途的消毒因子对病毒的灭活效果。 2.1.10.2 实验器材
（1）实验用病毒株 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（human immunodeficiency virus，HIV-1）美国株
（2）宿主细胞 可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-Ⅰ的测试细胞。用含有人T淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。
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（3）细胞培养瓶 （4）96 孔培养板 （5）恒温水浴箱 （6）二氧化碳培养箱 （7）二级生物安全柜
（8）低温冰箱（-20℃，-80℃） （9）液氮罐 （10）倒置显微镜 （11）低温高速离心机
（12）可调移液器及配套一次性塑料吸头 （13）细胞维持培养基 见附录A （14）细胞完全培养基 见附录A
（15）去离子水、标准硬水（硬度为324mg/L）
（16）有机干扰物 对未清洗较脏的物品用 3.0% 牛血清白蛋白。对已清洗较清洁的物品用0.3% 牛血清白蛋白
（17）胎牛血清或新生牛血清 2.1.10.3 病毒悬液的制备
（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在 37℃ 温水中迅速融化，用毛细吸管移置于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，混匀，同上离心后，转种于加有 10mL 完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于传代或消毒试验。
（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，室温融化，用不含胎牛血清的培养基作10倍稀释，然后全部接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃ CO2培养箱中，吸附 1～2h，吸出病毒悬液，加入细胞维持液，至37℃ CO2培养箱内培养。待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
（3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或室温与-20℃反复冻融3次）破碎宿主细胞或用其他相应的方法破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管 1.0mL 分装于无菌离心管（1.5mL）中。
（4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余置 -80℃冷冻保存备用。 2.1.10.4 病毒载体的制备
（1）按 2.1.2.4 制备载体。
（2）取出低温冻存的病毒悬液，室温融化，与等量有机干扰物混合，取 0.01mL 滴染于载体片上，室温凉干后备用。 2.1.10.5 病毒滴度测定
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消毒技术规范（2008年版）
