（1）操作步骤
用细胞维持液对样本做系列10倍稀释，每个稀释度滴加 4 孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞）于培养板上，置37℃ CO2培养箱 1h～2h，确保病毒吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持液。放入CO2培养箱中（37℃，5%CO2）培养，每日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d～5d，逐孔记录细胞病变情况。
（2）病毒滴度的计算
病毒滴度以半数细胞感染剂量（TCID50）表示，TCID50的对数值计算公式如下： TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例 具体计算步骤如下：
1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积（见表 2-2）。
各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）（见表 2-2）。
2）计算距离比例。距离比例可按下式计算：
距离比例?
高于50%组的病变率?50
高于50%组的病变率?低于50%组的病变率注：病变率高于 50% 组是指病变率超过50%的最低组，以下简称高于 50% 组；病变率低于50% 组是指病变率低于 50% 的最高组，以下简称低于 50% 组。
计算举例：设试验数据如表 2-2。
表 2-2 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果
样本 稀释度 10 10 10 10 10
-8-7-6-5-4
接种 孔数 4 4 4 4 4
细胞病变 - 0 0 1 3 4
+ 4 4 3 1 0
累积值
细胞病变（-） 0 0 1 4 8
细胞病变（+） 12 8 4 1 0
12/12 8/8 4/5 1/5 0/8 病变比
病变率（%） 100 100 80 20 0
本例，高于50%组病变率（%）为80；低于 50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度对数值为6。
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距离比例?80?50?0.5
80?20TCID50 对数值 = 6＋0.5 = 6.5
2.1.10.6 残留消毒剂中和稀释法的鉴定试验
（1）目 的
确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。 （2）试验设计原则
1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒药物有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响。
2）根据试验目的，选择适宜的病毒株和细胞株。
3）中和试验用消毒剂浓度应为最高使用浓度，最短作用时间不得少于30s。 （3）实验分组
1）中和剂 + 病毒悬液 → 细胞维持培养基系列稀释，接种细胞培养 观察中和剂对病毒有无抑制作用。
2）（消毒剂 + 中和剂） + 病毒悬液 →细胞维持培养基系列稀释，接种细胞培养 观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。 3）病毒悬液 →细胞维持培养基系列稀释，接种细胞培养 观察病毒是否可正常生长，并将其结果作为阳性对照值。 4）未接种病毒的细胞 → 培养 观察其生长是否正常。
（4）病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序
1）按 2.1.10.3 制备病毒悬液。消毒剂用标准硬水按规定浓度的 1.25倍配制，备用。 2) 中和剂鉴定试验分以下4组：
第 1 组 吸取 0.98mL中和剂溶液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴5min，加入 0.02mL 病毒悬液，混合均匀，作用10min，以细胞维持培养基作系列稀释，取样作为第1组样本。
第 2 组 吸取 0.98mL中和产物（0.9mL中和剂＋0.08mL消毒剂溶液）于试管内，置 20℃±1℃ 水浴5min，再吸加 0.02mL 病毒悬液，混合均匀，作用10min，以细胞维持培养基作系列稀释，取样作为第2组样本。
第 3 组 吸取 0.98mL细胞维持液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴5min，再吸加 0.02mL 病毒悬液，混合均匀，作用10min，以细胞维持培养基作系列稀释，取样作为第3组样本。
第 4 组 将试验用细胞，加细胞维持液。
3）将第1～3组样本进行病毒滴度测定，观察第 4 组细胞生长情况。 （5）病毒载体定量中和剂鉴定试验操作程序
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1）按 2.1.10.4 制备染毒载体。 2）中和剂鉴定试验分以下4组：
第 1 组 吸取中和剂 1.0mL 于无菌试管中，将其置 20℃±1℃ 水浴5min，用无菌镊子夹入1片病毒载体片，并使浸透于中和剂内，作用 10min，用细胞维持液做系列10倍稀释，取样作为第1组样本。
第 2 组 吸取中和产物溶液（以浸有消毒剂的载体置 1.0mL 中和剂内，作用 10min） 1.0mL 于无菌试管中，将其置 20℃±1℃ 水浴5min，用无菌镊子夹入1片病毒载体片，并使浸透于中和产物溶液中。作用 10min，用细胞维持液做系列10倍稀释，取样作为第 2 组样本。
第 3 组 吸取细胞维持液 1.0mL 于无菌试管中，将其置 20℃±1℃ 水浴 5min，用无菌镊子夹入 1 片病毒载体片，并使浸透于细胞维持液中。作用 10min，用细胞维持液做系列 10倍稀释，取样作为第 3 组样本。
第 4 组 将试验用细胞，加细胞维持液。
3）将第 1～3组样本进行病毒滴度测定，观察第 4 组细胞生长情况。 （6）3d～5d 记录试验结果，试验重复3次。 （7）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格：
1）第1、2、3组病毒滴度的误差率小于50%，悬液定量法病毒滴度对数值为5～7，载体法病毒滴度对数值为4～6。
2）第4组细胞生长正常。 3）连续3次试验取得合格评价。
2.1.10.7 残留消毒剂物理去除方法的鉴定试验要点
病毒灭活试验中的物理去除法，首选稀释法，其次为吸附柱法、分子筛柱法、载体冲洗法。 （1）分 组
1）（病毒悬液 + 消毒剂）+ 除药处理 → 细胞维持培养液系列稀释，接种培养 观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用。
2）病毒悬液 + 除药处理 → 细胞维持培养液系列稀释，接种培养 观察除药处理对病毒滴度有无影响。
3）病毒悬液 → 细胞维持培养液系列稀释，接种培养 观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值。 4）未接种病毒的细胞 → 培养 观察细胞生长是否正常。 （2）悬液定量操作程序
1）按 2.1.10.3 制备病毒悬液。消毒剂用标准硬水按规定浓度 1.25倍配制备用。
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2）中和剂鉴定试验分以下4组：
第 1 组 吸消毒剂 0.8mL 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中经 5min 后，吸加 0.2mL 病毒悬液，混匀。待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，根据试验规定量，吸取最终样本 （或用细胞维持培养液系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
第 2 组 吸取病毒悬液 0.2mL，加 0.8mL 细胞维持培养液，做除药处理。根据试验规定量，吸取最终样本（或用细胞维持培养液系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
第 3 组 吸取病毒悬液 0.2mL， 加细胞维持培养液 0.8mL，不加消毒剂亦不做任何除药处理。直接进行病毒滴度测定。
第 4 组 向未接种病毒的细胞管内，加入细胞维持培养液进行正常培养。 （3）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格：
1）第 1 组无试验病毒或仅有少量病毒生长。且明显少于第 2 组、第 3 组的病毒生长。 2）第2、3组病毒生长量相近，二者差异不超过 1 个对数滴度。 3）连续 3 次试验取得合格评价。
4）可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。 2.1.10.8 脊髓灰质炎病毒灭活试验
（1）目 的
验证各种消毒因子对病毒的灭活效果。 （2）悬液定量灭活试验操作程序
1）按 2.1.10.3 制备病毒悬液，低温保存备用。
2）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至说明书设定的作用浓度的 1.25倍，置 20℃±1℃ 水浴中备用。
3）取 0.1mL 有机干扰物与等量病毒悬液混合，置 20℃±1℃ 水浴 5min，加入 0.8mL 消毒剂样品混匀，作用至设定时间，取 0.1mL 加入到 0.9mL 的中和剂中混匀，用细胞维持液做系列 10倍稀释，取样进行病毒滴度测定。
4）阳性（病毒）对照组试验中，用细胞维持液代替消毒剂，其它同实验组。 5）试验重复3次。
（5）脊髓灰质炎载体定量灭活试验操作程序 1）按 2.1.10.4 制备病毒载体。
2）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至说明书设定的作用浓度，于 20℃±1℃ 水浴中备用。 3）取无菌平皿，按每片 5.0mL 的量，吸取消毒液注入平皿中。
4）将平皿置 20℃±1℃ 水浴 5min 后，用无菌镊子分别取病毒载体片浸没于消毒液中。 5）作用至设定时间，取出载体片分别移入含 1.0mL 的中和剂试管中。振打80次，进行病毒滴度测定。
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6）直接将病毒载体片加到含 1.0mL 细胞维持液的试管中，振打80次，进行病毒滴度测定，作为阳性对照组。
7）试验重复3次。
（6）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50）为Nx。
平均灭活对数值 = lgN0－lgNx （7）评价规定
1）悬液定量杀灭试验中，杀灭对数值≥4.00，阳性对照组病毒滴度对数值在 5～7 之间为消毒合格。
2）载体定量灭活试验中，杀灭对数值≥3.00， 阳性对照组病毒滴度对数值在 4～6 之间为消毒合格。
2.1.10.9 艾滋病病毒灭活试验
（1）目 的
测定消毒剂对艾滋病病毒灭活所需的剂量，以验证对该病毒污染物消毒的实用剂量。 （2）实验原理
用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或试验组与对照组）样本中 HIV 的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对 HIV 的灭活对数值。
（3）安全防护
试验中要求采取严密防护措施。我国规定所有接触 HIV 的试验均需在生物安全三级（biological safety level 3，BSL 3）实验室内进行，并制定有相应的安全防护措施。在 HIV 灭活试验时，必须严格按照有关安全规定进行。
（4）实验分组
1）试验组 根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设立适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于 30s。所设组应能测出使 HIV 全部灭活所需的最低有效剂量（药物浓度与作用时间）。
2）阳性对照组 用细胞维持液代替消毒剂，按试验组规定步骤加入 HIV 悬液进行试验和培养，观察 HIV 生长是否良好。
3）阴性对照组 用不含 HIV 的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。
4）消毒剂对细胞毒性组 取系列稀释的不同浓度的待测消毒剂各100μL，分别加入含有100μL 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞400 000 个/mL）的 96 孔培养板内。置二氧化碳恒温培养箱（37℃）中培养 7d，观察细胞生长情况，确定对细胞无毒性的消毒剂最高稀
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消毒技术规范（2008年版）
