实验原理
体外培养的淋巴细胞，在受植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白（ConA）等非特异性有丝分裂原的刺激时，可转化为淋巴母细胞，称为淋巴细胞转化试验（Lymphocyte transformation test，LTT）。淋巴细胞转化率的高低可反映机体细胞免疫水平，因此在临床上常作为检测细胞免疫功能的指标之一。
实验材料
1.细胞培养液、植物血凝素（PHA）、淋巴细胞分离液、Hanks液、瑞氏染液 2.肝素抗凝管、滴管、吸管、刻度离心管、试管、细胞培养瓶、玻片、镜油
实验方法
1. 取培养瓶（链霉素瓶洗净后高压灭菌），在超净台或接种箱内按无菌操作加入3～5ml
配好的RPMI1640细胞培养液。或者培养液配好后先分装于瓶中，小瓶用消毒橡皮塞塞紧，胶布封口，冰冻保存，需用时室温或37℃融化后使用。
2. 用消毒注射器取肝素抗凝血0.3ml（7#针头20滴）加入上述含培养液的培养瓶中。 3. 按每5ml培养液加入5mg/mlPHA溶液0.2～0.3ml，使培养基中PHA的浓度达到200～
300μg/ml。置37℃温箱中培养72小时，培养期间每天振摇一次。
4. 培养结束，吸弃瓶内上清液，取Tris-NH4Cl溶液3ml加入瓶内，充分混匀。移入离
心管内，置37℃水浴10分钟。
5. 加适量生理盐水混匀，以1500转/分，离心10分钟，弃上清，共洗2次，摇匀沉
淀细胞，推片，干燥，瑞氏染色。
结果观察
根据细胞大小、胞核和胞浆特征等进行判别。转化过程中，常见的细胞类型有成熟淋
巴细胞、过渡型淋巴细胞、淋巴母细胞、核分裂相细胞等。其具体形态特征如下： 成熟淋巴细胞：（1）直径6～8μm；（2）核质紧密，无核仁；（3）着色较深；（4）胞浆较少。图8a
过渡型淋巴细胞：（1）体积较成熟淋巴细胞略大，直径为12～16μm；（2）核质较疏松，有或无核仁；（3）着色较淡；（4）胞浆增多、嗜碱性、空泡及伪足样突起可有可无。见图8b、c 淋巴母细胞：（1）体积明显增大，直径为12～20μm；是成熟淋巴细胞的3-4倍。（2）核疏松呈网状结构并有1-3个核仁；（3）核周有淡染区；（4）胞浆丰富呈嗜碱性，有伪足样突起，有时可见空泡。见图8d、e
核分裂相细胞：即染色体型淋巴细胞。核呈有丝分裂，可见成堆或散在的染色体。 在油镜下观察计数200个淋巴细胞，根据淋巴细胞转化的形态学指标计算出淋巴细胞转化的百分率。其中，过渡型淋巴细胞、淋巴母细胞和核分裂相细胞作为转化细胞。 淋巴细胞转化率% =
转化型细胞数?100％
转化型细胞数＋未转化型细胞数正常值为60%～80%，低于50%为降低。 注意事项
1.本试验要求严格进行无菌操作，否则会污染影响试验效果。
2.PHA的加入量要适当，过多或过少都会影响转化率。一般需根据不同的厂家、批号及实践经验定量。
第三单元 细胞因子检测
随着免疫学理论研究的深入，细胞因子在免疫应答的调节和效应中起着重要作用，其体内水平的高低直接反映机体的免疫状况及与各种疾病的关系，因而细胞因子的检测受到重视。
方法主要分三类：（1）细胞生物学活性检测法。（2）免疫学标记技术法，常用ELISA。（3）分子生物学方法，常用逆转录PCR检测细胞因子的mRNA转录的情况。这三类检测方法各有其优缺点，在目前尚不能相互替代。
本单元实验以生物学活性检测方法为主，概要介绍有关细胞因子检测的最基本原理和方法，希望由此能完成以下的学习要求：
1．掌握现有的细胞因子检测技术的基本原理和方法类型。 2．熟悉主要的生物学活性试验的原理和操作。 3．了解细胞因子检测方法的应用。
实验十 白细胞介素-2（IL-2）生物学活性测定
实验目的
1.掌握IL-2生物学活性测定的原理。
2.熟悉IL-2生物学活性测定的实验方法和结果计算。
实验原理
IL-2是由Th细胞产生的淋巴因子，在淋巴细胞增殖分化过程中起到非常重要的作用。IL-2活性测定基于IL-2能维持IL-2依赖细胞的代谢和存活，促进这类细胞的增殖。细胞在增殖时能量代谢活跃，可产生大量的能量以供合成多种大分子物质和细胞分裂所需，能量代谢的水平与细胞合成DNA水平基本平行，因此，测定细胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞增殖情况。
MTT（四甲基偶氮唑盐）是一种淡黄色的水溶性化合物，活细胞（特别是增殖期的细胞）通过线粒体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶的作用，使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状甲臢沉积于细胞内或细胞周围，且形成甲臢的量与细胞增殖程度呈正比，甲臢经SDS作用后可溶解显色。溶解液的光密度值与细胞代谢及IL-2活性正相关。
实验材料
1.1640培养液（完全）、IL-2标准品、待测IL-2样品、CTLL-2细胞株、MTT溶液（5mg/ml）、10%SDS
2.96孔细胞培养板、多头细胞收集器、微量加样器、CO2孵箱、酶标仪
实验方法
1.制备CTLL-2细胞悬液 取生长旺盛的CTLL-2细胞，用1640培养液将细胞洗3次，
5
用完全1640培养液配成2×10/ml细胞悬液。
2.稀释样品和标准品 将待测样品和标准IL-2用完全1640培养液做一定的倍比稀释。 3.加样与检测 向96孔细胞培养板内加入不同稀释度的样品和标准品（50μl/孔），每稀释度3个复孔，并设细胞对照。再向各孔加入50μl细胞悬液，混匀，置5%CO237℃培养36小时，每孔加入MTT溶液20μl CO2孵育6～8小时后，每孔再加10%SDS100μl，充分混匀，37℃孵箱静放（使甲臢全溶解）。在酶联仪上选波长570nm测定OD值，将待测样品的OD值与标准品OD值比较后，求得待测样品的IL-2活性单位。
结果计算
将各稀释度的OD值按照样品最大增殖OD值的百分比换算成概率单位，可将原来呈S形的曲线转换成为直线。根据这些点的数据求出各直线的回归方程。再从回归方程求出各样品达50%最大增殖时的稀释度，而后按下列公式求出待测样品IL-2的活性单位。 计算公式：
x?d?a D x 待测样品IL-2活性单位（μ/ml）； a：标准参考样品IL-2的活性单位（μ/ml）； d 待测样品达50%最大增殖的稀释度； D：标准参考样品在50%最大增殖的稀释度。
注意事项
1． MTT液要现配现用，避免光照，若有蓝色颗粒需过滤后再用。
2． 生物学测定法敏感性高，特异性强，所测IL-2是具有生物活性的IL-2，而不象免疫学
测定法所测定免疫反应性IL-2蛋白，因此测定的条件和要求要严格按规程。
实验十一 血清可溶性白介素-2受体（sIL-2R）水平的检测
实验目的
1．了解sIL-2R检测的基本原理
2．掌握sIL-2R检测的方法的临床意义。
实验原理
sIL-2R可与细胞膜表面的受体（IL-2R）竞争结合IL-2，从而成为一种免疫抑制物质。在正常人血清和尿液中可检出低水平的sIL-2R，在某些疾病发生时如器官移植、排斥反应、病毒性感染、恶性肿瘤、创伤和自身免疫病等，sIL-2R在血清和其他体液中的水平增高，且与病情、病程密切相关。本实验采用双抗体夹心法测定原发性肝癌患者血清sIL-2R水平。（夹心法原理参见实验五免疫酶技术）
即： 抗体-——待检血清——抗体——酶标抗抗体——显色
实验用品
1．材料、试剂：待测人血清、IL-2Rα阳性、阴性参考血清、IL-2Rα单抗、兔抗IL-2Rα多克隆抗体、酶结合物（HRP-抗兔IgG）、显色A液、B液、PBS洗涤液、终止液。
2．器具：吸管、滴管、试管、48孔聚苯乙烯反应板、50μl微量移液器、恒温箱（370C）
实验方法
预步骤：先用一定浓度的IL-2Rα单抗包被聚苯乙烯板的小孔，4℃冰箱过夜，次日取出甩尽液体备用。
（1）微量移液器分别加待检血清、阳性对照、阴性对照各50μl于1、2、3孔中，370C水浴箱温育40min。
（2）PBS液洗板3次，每次3min，甩干。
（3）每孔加入兔抗IL-2Rα多抗，370C水浴箱温育30min。 （4）用PBS液洗板3次，每次3min，甩干
（5）每孔加入酶结合物（HRP-抗兔IgG）2滴，370C水浴箱温育30min。 （6）每孔分别加入显色A液、B液各1滴，混匀。370C水浴箱温育5-10min。 取出肉眼观察结果。如待检血清溶液与阳性对照一致均为蓝色，表明待检血清为sIL-2R阳性血清。
皖南医学院：医学免疫学（实验指导）
