2、两侧各加抗HCG（HCG诊断血清）一滴，混匀2分钟。 3、两侧各加HCG—乳胶抗原一滴，混匀2分钟，观察结果。
结果分析
左侧对照实验：出现均匀的凝集颗粒。
妊娠诊断试验阴性：出现凝集现象，即凝集未被抑制，说明待检尿液中无HCG。
妊娠诊断试验阳性：不出现凝集，即凝集被抑制，说明待检尿液中有HCG。 不凝集 凝集
（试验阴性） （试验阳性）
沉淀反应
基本原理
可溶性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线。
实验四 凝胶沉淀反应
一、单相琼脂扩散试验 原理
一种定量试验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固后，在琼脂层上打孔，再将抗原加入孔中，使其向四周扩散。抗原抗体复合物形成的沉淀环直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从标准曲线中求出。本试验主要用于检查标本中各种免疫球蛋白和血清IgG含量。
材料
１．抗体：羊抗人IgG单价抗血清。 ２．抗原：待检血清。
３．３％生理盐水琼脂、生理盐水、载玻片、直径３mm打孔器、小三角烧瓶、毛细滴
管、湿盒。
方法
1、制备含抗体的琼脂板
取羊抗人IgG单价抗血清一瓶（效价1：80），量取0.3ml于一小三角烧瓶中，加生理盐水11.7ml（40倍稀释混匀，置56℃水浴中恒温2~3分钟）。
取3%生理盐水琼脂一管，隔水加热使溶，然后置56℃水浴中，待琼脂温度降至56℃时，立即加入等量1：40稀释抗血清，迅速轻轻混匀，勿使产生气泡，迅速倾入载玻片上，每片3.5ml，待凝固后打孔。如下图所示。
2、稀释待检血清
将待检血清用生理盐水作40倍稀释， 3、打孔、加样
每份检样加两孔，加满（但不要溢出），加样时毛细滴管尖端不要划破琼脂。 4、温育
将琼脂板置搪瓷盒，垫湿纱布或海绵以防干燥，37℃恒温箱24h。
结果观察与分析
测量并求出每份检样两孔的沉淀环平均直径，按照标准曲线求出IgG含量。
标准抗原
待检抗原
沉淀环直径（mm）
7
5
3
50 100 500 1000 标准抗原浓度（mg/100ml） 标准曲线图
二、双向琼脂扩散试验 原理
常用于定性检测，也可用于半定量检测。将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶板上相邻近的小孔内，让它们相互向对方扩散。当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。临床常用本方法检查原发性肝癌患者血清中的甲胎蛋白，作为原发性肝癌的早期辅助诊断。
甲种胎儿蛋白（α-Fetal protein, AFP），是胎儿组织及体液中的正常组织成份。胎儿在第9周才出现此种蛋白，13~19周达高峰，到21周后逐渐下降，胎儿出生后该蛋白即行消失或含量甚微，普通试验方法检查不出，而肝癌病人及个别卵巢癌或睾丸癌病人的血清检出有此种蛋白。
材料
1．抗AFP血清、已知肝癌病人AFP阳性血清、待检病人血清。 2．1.2%琼脂（用生理盐水配成）。 3．载玻片、毛细吸管、湿盒。
方法
1．制备琼脂玻片 将已知加热溶化的1.2%琼脂3.5ml，迅速倾入载玻片上。
2．打孔 待凝固后用打孔器按下图样打孔。（孔径3mm，孔距4mm）
2、3、5孔待检血清为AFP阳性
3．加样
以上方孔为第1孔，按顺时针方向分别称为2、3、4、5和6孔，中央孔为7孔。7孔加入抗AFP血清，1、4孔加入已知AFP阳性血清（或AFP），作为阳性对照孔；6孔加入已知AFP阴性血清，作为阴性对照孔，其余2、3、5孔为试验孔，加入待检血清。
4．温育 置湿盒室温或37℃温育12-24 h。
结果观察
1、4孔与7孔间应出现白色沉淀线（如上左图1与7，4与7），6与7孔间应不出现白色沉淀线。若2、3、5孔与7孔间出现白色沉淀线而且与阳性对照沉淀线吻合者如图中2、3、5与1、4孔间，即为实验阳性，表明待检血清中含有AFP（即AFP阳性）。如出现与阳性对照相连接，且呈枪刺状如上右图中4与5孔间，说明二者间有共同抗原成分；如出现成交叉的沉淀线如上右图3与4，则是非特异性沉淀反应，为假阳性反应，乃判为实验阴性，表明待检血清为AFP阴性。
三、 对流免疫电泳
原理 在一定条件下，胶体颗粒是带有电荷的，这些带电胶体颗粒在电的影响下发生
移动。如胶体颗粒带负电，则移向阳极；反之，移向阴极。这种现象称为电泳。
对流免疫电泳是将病人血清（待检抗原）放在琼脂板阴极端孔内，已知抗血清（含有已知抗体）放于阳极端孔内，在碱性环境条件下同时进行电泳，抗原由阴极向阳极移动快，而抗体系丙种球蛋白，等电点在pH6~7之间，故带负电荷少，移动速度慢，由于电渗作用结果向阴极倒退，于是抗原抗体在电场中相遇，当两者比例适当时，则特异性抗原抗体互相结合，便形成肉眼可见的白色沉淀线。
材料
1．1%，PH8.6，0.075M巴比妥缓冲液。
2．抗AFP血清，已知AFP阳性血清，待检病人血清。 3．玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、电泳仪等。
方法
1．将用缓冲液配制好的1.2%琼脂隔水加热溶化，趁热吸取3.5ml加于玻片上，冷凝后打孔，孔直径3毫米，二孔间距离3毫米。
2．分别从上至下向左列1、3、5孔内加入抗AFP血清；向右列2孔内加待检病人血清，4孔内加已知AFP阳性血清作为阳性对照，6孔内加已知阴性对照血清。各孔加满为度，勿使外溢，
3．将琼脂板置于电泳槽内，抗原端入阴极侧，抗体放阳极侧，二端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。
4．通电，固定电压5-6伏/厘米长，通电45~60分钟左右。
结果观察
电泳毕，关闭电源，取出琼脂板。在黑色背景上方，透过散射光线，首先观察3与4孔间（阳性对照组）、5与6孔间（阴性对照组）的白色沉淀线是否出现；再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为AFP阴性血清。
Ab
+ 11
-
Ag
四、火箭免疫电泳
原理： 火箭免疫电泳是将电泳与单向扩散结合的一种免疫技术。将抗体溶入琼脂后制板，
在琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的含量成正比，故可定量测定抗原。
方法：
1、制备琼脂板
将抗体血清按一定比例与溶化好的1.5%琼脂在56℃水浴中混匀，迅速浇注成2毫米厚的琼脂板。 2、打孔
3、加样：分别加入已知浓度的标准抗原溶液和待测抗原，每孔10微升。
4、电泳：将琼脂板放入电泳槽，抗原放阴极侧，抗体放阳极侧，两端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。固定电压5~6伏/厘米长，通电时间为45~60分钟左右，观察结果。
Ag
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免疫标记技术
实验目的
1、 熟悉酶免疫技术基本原理和方法、免疫荧光技术的基本原理。 2、 了解酶联免疫吸附实验（间接法）的基本过程及其作用。 实验用品
1、 材料、试剂：待测人血清、ACA阳性、阴性参考血清、显色A液、B液、PBS洗涤液、
酶结合物（HRP-SPA）、终止液。
2、 器具：吸管、滴管、试管、48孔聚苯乙烯反应板、50μl微量移液器、恒温箱（370C）、
荧光显微镜。 内容和方法
免疫标记技术是一种用某些物质（如酶、荧光素、放射性同位素等）对抗体或抗原进行标记（这种标记不致影响抗原抗体之间的特异结合），然后再通过检测标记物来观察抗原抗体反应的实验方法。它的突出优点是可以大大提高实验的敏感性，它还可以对组织标本中的抗原或抗体进行定位鉴定，也可以对样品中的抗原或抗体进行定量测定。按标记物种类的不同，下面分别对免疫酶技术和免疫荧光技术进行简要的介绍。
实验五 免疫酶技术
1、 原理
免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以 酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行，从而简化了分离步骤，提高了灵敏度，即可检测抗原，也可检测抗体。实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。
为了检测抗原可用夹心法。将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上，然后加被测溶液，倘样品中有相应抗原，则与抗体在载体表面形成复合物。洗涤后加入酶标记的特异性抗体，后者通过抗原也结合到载体的表面。洗去过剩的标记抗体，加入酶的底物，在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比，可用肉眼观察或分光光度计测定。
为了检测抗体可用间接法。使抗原吸附于载体上，然后加入被测血清，如有抗体，则与抗原在载体上形成复合物。洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。洗涤后加底物显色，有色产物的量与抗体的量成正比。（见图5-1）
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD）和对硝基苯磷酸盐，前者呈色反应为棕黄色，后者为蓝色。可用目测定性，也可用酶标仪测定光密度（OD）值以反映抗原含量。
E + 底物 显色
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图5-1
皖南医学院：医学免疫学（实验指导）
