医学免疫学实验指导
皖南医学院微生物学免疫学教研室
2004年12月
实验室规则
实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段，为保证实验效果，同时避免病原微生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：
一、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。
二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。
三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。
四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应立即报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。
五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后立即投入已准备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。
六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。
七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。
第一单元 体外抗原抗体反应
实验目的
掌握体外抗原抗体反应的特点和影响因素；
掌握经典的体外抗原抗体反应的原理、方法和应用。
凝集反应
基本原理 颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。
实验一 直接凝集反应
一、玻片凝集试验 （一）血型鉴定
目的 掌握玻片凝集反应的原理和应用；熟悉ABO血型的鉴定方法。
原理 将已知标准抗A和抗B血型抗体分别与待测红细胞混合。如果抗原与抗体相对应，
则引起红细胞凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断血型。
材料 1、标准的抗A和抗B单克隆抗体（抗A为蓝色，抗B为黄色）
2、酒精棉球、采血针、生理盐水、试管、滴管、载玻片、蜡笔。
方法 1、酒精棉球消毒耳垂或手指末端后，用采血针刺破皮肤，取1—2滴血放入盛有
0.5ml
生理盐水的试管中，混匀制成红细胞悬液。
2、取载玻片一张，用蜡笔划分为两格，分别注明A和B，并在相应部位各加一滴
标准抗A和抗B单抗。
3、用滴管取红细胞悬液于抗A、抗B单抗中各加一滴。手持玻片，前后左右轻轻转动，促其充分混匀。
结果观察：
如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者，即为红细胞凝集；如混合液仍呈均匀混浊状，则为不凝集。
如肉眼观察难于判定是否凝集，可在显微镜下用低倍镜观察予以确认。
A B
不凝集（-） 凝集（+）
表1-1 血型鉴定试验结果与判定 诊断血清 凝集反应 抗A 抗B 血型 A + - B - + AB + + O - -
（二）菌种鉴定 在与《医学微生物学》的综合性实验中做 目的 观察细菌在玻片上与其相应抗体结合所出现的细菌凝集现象，理解抗原抗体反应的
特异性。
原理 将已知细菌抗体与待测细菌混合，如果抗原与抗体相对应，则引起细菌凝集，反之
则不凝集，据其凝集现象可判断细菌种类。
材料 1、 1：20痢疾杆菌免疫血清，1：20伤寒杆菌免疫血清。
2、 痢疾杆菌培养物。
3、 生理盐水、玻片、记号笔、接种环、酒精灯、消毒缸等。
方法 1、 取洁净玻片1张，用记号笔划分三等份，如下图所示：
2、 用接种环分别取生理盐水、1：20伤寒杆菌免疫血清、1：20痢疾杆菌免疫血
清各3-4环按图示位置放在玻片上，注意在换取另一种血清时要烧灼接种环，以免混淆血清产生错误结果。
3、 用接种环挑取少量痢疾杆菌加入玻片的生理盐水中，充分混匀，再挑取少量
痢疾杆菌加人1:20伤寒免疫血清中混匀，同法挑取痢疾杆菌加入1：20痢疾杆菌免疫血清中，混匀。注意无菌操作。 4、 轻摇动玻片，1—2分钟后观察
NS 伤寒杆菌免疫血清 痢疾杆菌免疫血清 + + + 痢疾杆菌 痢疾杆菌 痢疾杆菌
结果观察
阳性：液体变清，并有乳白色凝集块出现。 阴性：液体仍然混浊，，无凝集块出现。
记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器内，切勿任意放置或冲洗。
-（阴性）
+ （阳性）
注意 取细菌培养物时不宜过多，与免疫血清混合时，必须将细菌涂散、涂均匀，但不
宜将面积涂得过大，以免很快干涸而影响结果观察。
二、试管凝集反应——血型抗体效价滴定
在与《医学微生物学》的综合性实验中做
目的 了解试管凝集反应方法；掌握凝集效价的判定及其意义。 材料 1. A或B型试者血清、 生理盐水
2. A或B型红细胞悬液 3. 小试管、试管架、吸管 4. 37℃恒温培养箱等。
方法 取7支小试管，标1—7号。按上表加样，将待检血清进行倍比稀释。在第1~7
管内加入红细胞悬液各0.5 ml。（注意：加样顺序由后往前加） 充分混匀后，置37℃恒温箱30分钟后观察记录结果。
表1-2 试管凝集实验方法和结果举例
试管号 1 2 3 4 5 6 7 （对照） 生理盐水（ml） 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 待检血清（ml） 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 （弃0.5） - 红细胞（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
血清稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 - 37℃ 30 分钟
结果判定 ++++ ++++ +++ ++ + - -
结果观察：
先观察生理盐水对照管（第7管），应不发生凝集，液体混浊，管底沉淀呈圆形，边缘整齐。此沉淀物为红细胞悬液静置时因重力作用自然下沉形成。然后自第6管开始依次观察管内液体的混浊程度及管底凝集块的大小。
血清对倍稀释方法：
用吸管将第1管的溶液连续吸吹三次，使其充分混匀后吸出0.5 ml移入第2管（先反复练习吸吹方法，待掌握操作方法后再进行正式试验），同法使充分混匀后吸出0.5 ml 移入第3管，如此作倍比稀释至第6管，从第6管吸0.5 ml弃去，第7管为不加血清对照。
【结果判定】
凝集物 上清液 凝集程度 全部凝集 澄清 ++++（最强凝集） 大部份凝集 基本透明 +++ （强凝集）
有明显凝集 半透明 ++ （中度凝集） 很少凝集 基本混浊 + （弱凝集）
不凝集 混浊 — （不凝集） 孔底凝块观察：
++++ +++ ++ + —
凝集效价（血清凝集滴度）的判定：
通常以能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（++）的血清最高稀释度为血清凝集效价。上表所示结果，血清效价为1：160
实验二 间接凝集反应（类风湿因子检测）
原理
类风湿因子（ rheumatoid factor RF）是抗人或动物IgGFc段的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。IgM型RF被认为是RF的主要类型，也是临床免疫检验中常规方法所测定的类型。
IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上作为检测试剂，在反应介质中，待检血清中如含有RF，可与胶乳颗粒出现凝集反应。这是检测IgM型RF的常用方法，但此方法只能定性或以滴度半定量，其灵敏度和特异性均不高，且只能检出血清中的IgM型RF。 检测方法：
胶乳颗粒凝集试验
即一定稀释度的待检血清+Ig-胶乳颗粒1~2滴 凝集与否
实验三 间接凝集抑制试验------乳胶妊娠试验
原理
将待测样品中的抗原与已知抗体作用后，再与相应抗原—乳胶颗粒混合。因没有游离抗体的存在，乳胶颗粒表面的抗原不能与抗体结合出现凝集现象，即凝集被抑制。孕妇尿液中含HCG，用抗HCG与之结合后，再加HCG—乳胶，则不出现凝集现象。
方法
1、取玻片一张，左侧加生理盐水一滴，右侧加待检尿液一滴。
皖南医学院：医学免疫学（实验指导）
