人乙醛脱氢酶2的原核表达及其活性的鉴定
黄娟 王荷花 张小骥 潘博宇 陈孝平 吴元欣
【摘 要】商品化的乙醛脱氢酶主要从动物细胞、肝细胞线粒体中提取，其来源受到很大的限制，而且价格昂贵。为了解决乙醛脱氢酶原料有限的问题，利用微生物发酵法获取乙醛脱氢酶。 将人乙醛脱氢酶2基因（aldh2）克隆至原核表达载体pET32a中，构建重组载体pET32a-ALDH2。将构建的重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）进行诱导，SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白得到大量表达；且对诱导表达条件进行优化。结果显示，在37℃，1.0 mmol/L IPTG诱导表达6 h为最优表达条件。由于目的蛋白几乎都是以包涵体形式表达，为了得到有活性的乙醛脱氢酶，对包涵体变性、复性和纯化进行了研究。试验数据显示，酶的最终得率为14.49 U/L。并通过用Bradford法，测定复性蛋白的浓度约为77 μg/mL，进行活性检测表明，该复性蛋白具有乙醛脱氢酶活性，酶活性约为1.449 U/mL。通过构建重组载体pET32a-ALDH2和优化表达条件，aldh2在原核表达宿主E.coli BL21（DE3）得到大量表达；此外，利用透析复性法得到的复性蛋白酶活性有所提高。
【期刊名称】生物技术通报 【年(卷),期】2014(000)012 【总页数】6
【关键词】乙醛脱氢酶2 克隆 条件优化 酶活鉴定 【文献来源】
https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_biotechnology-
bulletin_thesis/0201254983890.html
人体内的乙醛脱氢酶主要有乙醛脱氢酶1（aldh1）和乙醛脱氢酶2（aldh2）两种，乙醛的氧化主要是依靠二者来完成，而aldh2对乙醛的活性要高出aldh1的50倍［1］。aldh2是乙醛脱氢酶的一
种，是人体酒精代谢的关键［2］。它在人体的主要作用是将人体内的酒精代谢后产生的乙醛脱氢氧化为无毒的乙酸，乙酸再进入TCA循环代谢为二氧化碳和水。在整个代谢过程中，乙醛脱氢酶是限速酶［3］。有研究报道，乙醛对人体有致癌作用，它与人类肿瘤的发生也有关系［4］。饮酒是食道癌的危险因素之一［5-7］。当人过量饮酒时，酒精的代谢产物乙醛不能及时被氧化，就会在体内积累，容易诱发肝癌［8］。由于aldh2在代谢乙醛中催化效率最高，所以aldh2在乙醛脱氢酶的研究中受到人们更广泛的关注。
目前，商品化的乙醛脱氢酶主要是从动物肝脏、肝细胞线粒体中提取，资源很有限且价格昂贵，大规模生产困难。获得乙醛脱氢酶比较传统的方法主要是从微生物体内提取，Zarnt教授［9］利用四氢呋喃甲醇培养基培养Ralstonia eutropha，并分离纯化出了乙醛脱氢酶。香港中文大学的Wing-Ping Fong和Ka-Fai Choy教授［10］提出了一种以草鱼的内脏为原材料，从其线粒体内分离提取aldh2的方法。该方法对原料进行匀浆混合预处理后依次通过高速离心分离，超滤浓缩并使用柱层析后得到比活为4.46 U/mg的aldh2。为了解决乙醛脱氢酶资源有限的问题，许多科研工作者都试图从微生物的发酵来获取大量的乙醛脱氢酶。黄坤等［11］利用毕氏酵母分泌表达aldh2时，在优化的诱导条件下可制备大量aldh2，但由于酵母的生长周期比较长，所以得到的目的蛋白的活性最高只能达到0.115 U/mL。赵锦等［12］也曾尝试过在酵母中表达乙醛脱氢酶，经分离纯化后的乙醛脱氢酶液的酶活为0.994 U/mL。由于受
酵母本底表达的影响，导致乙醛脱氢酶的表达量很少，而且表达出来的酶活性较低。
本研究通过更换表达载体和宿主菌来提高乙醛脱氢酶的表达量，即用原核表达载体pET32a在原核表达宿主E.coli BL21（DE3）中表达乙醛脱氢酶，并对表达条件进行优化。由于目标蛋白是以包涵体的形式表达，为了得到有活性的蛋白，所以对包涵体变性、复性和纯化，并对复性蛋白的活性进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 高保真酶Pyrobest DNA Polymerase，限制性内切酶Nde I、Pst I、Xho l、Sma I、EcoR V、EcoR I、T4 DNA Ligase、1 kb和500 bp DNA Marker购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒购自天根生物公司；琼脂糖凝胶、低溶点琼脂糖凝胶、IPTG、TEMED购自Sigma公司；蛋白分子量标准、丙烯胺购自北京普利莱公司；巯基乙醇、β-NAD、BSA购自Amresco公司；Ni-NTA Agarose购自Invitrogen公司。
1.1.2 菌株、质粒和培养基 用于分子克隆的宿主E.coli DH5α，用于表达的宿主E.coli BL21（DE3）由本实验室保存。原核克隆载体pBluescriptSKII和原核表达载体pET32a本实验室保存。带有aldh2基因的克隆载体pUC57-6His-ALDH2由本实验室构建保存。LB培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化钠10 g/L；固体培养基添加1.5%琼脂粉）用于大肠杆菌的培养。 1.2 方法
1.2.1 原核表达载体的构建
1.2.1.1 重组载体pBluescriptSKII-aldh2的构建 以pUC57-6His-aldh2为 模
人乙醛脱氢酶2的原核表达及其活性的鉴定
