释度。
（5）HIV 悬液定量灭活试验操作程序
1）从液氮中取出冻存的 MT4 细胞，在 37℃ 温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有 10mL 完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞对数生长期时收获细胞用于消毒试验。
2）从液氮中取出冻存 HIV-1 毒种，接种于含 10mL 细胞悬液（含细胞700 000个/mL～800 000个/mL）培养瓶中。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管 0.5mL 分装于无菌离心管（1.5mL）中，冷冻保存于-80℃备用。如不能立即离心，可暂将培养瓶冷冻保存于-20℃，并争取尽快离心分装。
3）取待测消毒剂，用无菌去离子水作 1:2、1:4、1:8 ...系列稀释。视消毒剂的类型和实验目的，确定最高稀释度。为防止污染培养液，必要时在试验前需将消毒剂过滤除菌。
4）取 100μL 有机干扰物，与100μL 病毒原液混合。加入0.8mL待检消毒剂后计时。待作用至规定时间，取出100μL，加入0.9mL 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（400 000 个/mL），在 37℃，放置 40min，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。阳性（病毒）对照组试验中，用无菌细胞维持液代替消毒剂；消毒剂对细胞毒性组试验中，用细胞维持液代替病毒。
5）取出反应管，立即采取去除残留消毒剂处理。处理可用物理去除法或中和稀释法（所用方法需先经试验证明，既可有效去除残留消毒剂，又对细胞和 HIV 无杀灭或抑制作用。
6）在 96 孔培养板上滴定样本中残留的病毒量。先在培养板（96孔）的各孔中，加入 100μL 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞 400 000 个/mL）。 同时，用完全培养基对待滴定样本做 1：10 系列稀释，然后取 100μL 稀释好的样本加入已含 MT4 细胞悬液的96孔培养板内。每个稀释度做 4 孔。
7）将按上述程序加液的 96 孔培养板，放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2），逐日在显微镜下观察细胞病变。被感染细胞融合肿胀，出现多核巨细胞。第 4 天，在各反应孔内补加 50μL 新鲜完全培养基。第 7 天，逐孔观察并记录细胞病变情况。
8）试验重复 3 次。 （6）评价规定
1）对测试滴度的HIV，3次灭活试验后均应不再检出，此时的灭活对数值应≥4.00，可判为该消毒剂浓度与作用时间，对HIV污染物消毒的实验室试验合格。
2）在正常情况下，HIV 阳性对照组病毒感染滴度（TCID50）对数值应在 5～7 之间。阴性对照组宿主细胞生长良好，并且无 HIV 检出。所用浓度的消毒液对宿主细胞生长无不良影响。否则，根据发现的问题，或调整 HIV 悬液浓度，或选择适宜消毒液浓度，或更换污染试剂和培养基，或改进其他有关条件后，重做试验。
（7）注意事项
1）操作人员应具有较丰富的病毒学实验工作经验，必须绝对遵守BSL3实验室的安全制度。
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身体状态欠佳，或有伤口时，应暂时停止工作。
2）有感染可能性的操作，均应在BSL3实验室的层流负压超净工作台中进行。
3）一旦发生事故，有病毒感染或污染环境的可能时，切莫惊慌，除立即进行妥善消毒处理外，并应尽快报告实验室和单位领导。
4）本试验周期较长，在全部过程中应注意防止样本污染。 2.1.11 消毒剂杀菌作用影响因素试验 2.1.11.1 目 的
对新消毒产品进行评价时，了解有机物、温度和pH 对消毒剂杀菌作用的影响规律。 2.1.11.2 实验器材
（1）菌片与菌悬液（按 2.1.2 要求和方法制备） （2）恒温水浴箱
（3）冷水浴装置（可放入试管架的容器，以冰水调节水温） （4）温度计 （5）pH 计
（6）有机物，根据消毒剂的使用对象选择，如酵母粉、血清、蛋白胨、牛血清白蛋白 （7）中和剂（经中和剂试验鉴定合格） （8）盐酸（用无菌纯化水配制） （9）氢氧化钠（用无菌纯化水配制） 2.1.11.3 实验微生物的选择
根据所测消毒剂鉴定需要决定。一般情况下，对细菌繁殖体应选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，作为革兰阳性与阴性细菌的代表；对细菌芽孢应选择枯草杆菌黑色变种芽孢。也可直接选择特定的微生物进行试验。
2.1.11.4 消毒剂浓度和作用时间的设定
试验中应分以下各组：
（1）试验组 各种因素影响的测定，均用杀灭相应微生物试验所得最低有效浓度和 3个作用时间进行杀灭试验。以该最低有效浓度所需的最短有效时间和最短有效时间的2倍、3倍为3个作用时间。试验结果应测出合格杀灭对数值的最低有效剂量。必要时，可根据需要调整消毒剂浓度或作用时间，若最短有效时间较长（＞30min），可根据情况适当缩短作用时间的组距。对最短有效时间较短者（＜5min），可根据情况适当延长作用时间的组距。
（2）阳性对照组 用标准硬水代替消毒剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表活菌浓度。
2.1.11.5 有机物对杀灭微生物效果影响的测定
（1）以小牛血清为有机物代表，应设置无小牛血清对照组；含 25% 小牛血清组；含 50% 小牛血清组等 3 组。各组所用消毒剂浓度和作用时间，见 2.1.11.4。
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（2）菌悬液与无菌小牛血清按 1:1 与3:1 比例混合，分别配成含 50% 与 25% 小牛血清的菌悬液。此含小牛血清的菌悬液，可用于悬液定量杀菌试验，亦可滴染菌片进行载体定量试验。
（3）以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定，试验程序见2.1.7。 （4）试验应重复 3 次。
（5）计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值。 2.1.11.6 温度对杀灭微生物效果影响的测定
（1）设置 10℃±1℃、20℃±1℃、30℃±1℃ 等，以 10℃ 为间隔。各组消毒剂浓度和作用时间的设置见 2.1.11.4。
（2）以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定，试验程序见2.1.7。 （3）试验应重复 3 次。
（4）计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值。 2.1.11.7 pH 对杀灭微生物效果影响的测定
（1）以该消毒剂的使用浓度 pH值和使用浓度的 pH值加2、pH值减2，设 3 组进行试验。对消毒液 pH值的调节，先用 pH计测定原消毒剂的 pH值，在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液，偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以调整。随时用 pH计测定消毒剂的 pH值。当达到所要求的 pH值后，停止调整，进行随后的试验。必要时，在 pH值调整后可测定有效成分含量以观察是否受到 pH值变化的影响。
（2）各 pH 组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.11.4。
（3）以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定，试验程序见 2.1.7。 （4）试验应重复 3 次。
（5）计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值。 2.1.11.8 评价规定
有机物影响试验以不含小牛血清组为对照，温度影响试验以 20℃±1℃ 组为对照，pH 影响试验以消毒剂使用溶液pH值组为对照。
（1）该组第 1个～3个作用时间杀灭效果均合格，判为该组所试因素无影响。
（2）该组第 1 个作用时间杀灭效果不合格，第 2 个、第 3 个作用时间杀灭效果合格，判为该组所试因素有轻度影响。
（3）该组第 1 个、第 2 个作用时间杀灭效果不合格，第 3 个作用时间杀灭效果合格，判为该组所试因素有中度影响。
（4）该组第 1个～3个作用时间杀灭效果均不合格，判为该组所试因素有重度影响。 2.2 消毒剂模拟现场和现场消毒效果鉴定试验
2.2.1 消毒剂对食（饮）具的模拟现场消毒效果鉴定试验 2.2.1.1 目 的
用于验证消毒剂对食（饮）具上细菌和病毒的消毒效果。
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2.2.1.2 实验器材
（1）实验菌株 大肠杆菌（8099），对尚需用于杀灭其他特定微生物者，可用该微生物进行试验。菌悬液制备按2.1.2规定的方法和要求进行。
（2）中和剂溶液 经中和剂鉴定试验合格 （3）稀释液 见附录A
（4）培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基
（5）有机干扰物 对用于清洗后食（饮）具消毒的消毒剂使用 0.3% 牛血清白蛋白，对用于未清洗的食（饮）具直接消毒的消毒剂使用 3.0% 牛血清白蛋白。
（6）无菌棉拭
（7）规格板（用可弯曲的软性材料制备，中央留一大小为5.00cm35.00cm空格作为采样部位）
（8）试验用食（饮）具样本 瓷碗（盘）或竹（木）筷前端（周长2.0cm， 长度12.5cm，总面积为25cm）
（9）标准硬水 见附录A 2.2.1.3 操作程序
（1）按产品使用说明书的浓度和作用时间进行大肠杆菌杀灭试验。
（2）用无菌规格板在试验用碗（盘）内表面标出染菌区。无菌操作吸取菌悬液，分别滴加于染菌区，每区0.1mL，涂匀，置37℃恒温培养箱至干燥。对筷子取前端12.5cm长度，蘸染预定量菌液后，置37℃或室温干燥。
（3）试验组 将10个染菌碗（盘）或10个筷子样本，依次定时放入含消毒剂溶液的容器中，使其完全浸没。作用至规定时间，轻轻取出碗（盘），弃掉消毒剂，分别向碗（盘）内的染菌区加入5mL中和剂溶液，用L棒刮洗染菌区，作用10min，分别取1.0mL样液，以倾注法接种2块平皿。轻轻取出筷子样本， 放入含 20mL～25mL 中和剂溶液的试管中，电动混匀器振荡20s或振打200次，作用10min，分别取1.0mL样液，以倾注法接种2块平皿。将接种好的平板放37℃恒温培养箱培养48h，计数菌落数，作为试验组。
（4）阳性对照组 直接向2个染菌碗（盘）的染菌区加入5mL中和剂，或直接将2支染菌筷子样本浸没于含20mL中和剂溶液的试管中。随试验组采样、检测，检测结果作为消毒前菌量，菌量应在 1310cfu/样本～5310cfu/样本。
（5）阴性对照组 将本次试验未用完的中和剂、稀释液、培养基等分别设阴性对照。
（6）以上试验重复 3 次。
（7）按下式计算每件食（饮）具上的生长菌落数。
每件食（饮）具样本生长菌落数（cfu/样本）=平板上平均菌落数3检测时样本稀释倍数 （8）按2.1.7.4（8）计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值。
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2.2.1.4 评价规定
阴性对照组均无菌生长，阳性对照组菌量为1310cfu/样本～5310cfu/样本，以每种食（饮）具30个样本中大肠杆菌杀灭对数值均≥3.00，所用消毒剂的浓度和作用时间为消毒合格剂量。
2.2.2 消毒剂对医疗器械模拟现场消毒效果鉴定试验 2.2.2.1 目 的
用于验证消毒剂对人工污染芽孢、分枝杆菌和白色念珠菌的医疗器械的消毒效果。 2.2.2.2 实验器材
（1）实验菌株 枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢（下简称芽孢，其悬液的制备按2.1.2.3（2）规定进行）；龟分枝杆菌脓肿亚种（ATCC 19977）；白色念珠菌（ATCC 10231）
（2）中和剂溶液 经中和剂鉴定试验合格
（3）培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基，分枝杆菌干燥培养基，沙堡琼脂培养基 见附录A （4）有机干扰物 0.3%牛血清白蛋白
（5）载体 医用止血钳齿端部分，按2.1.2.4（2）进行脱脂处理，灭菌后备用。 （7）塑料试管（1.8cm318cm） （8）标准硬水 见附录A 2.2.2.3 操作程序
（1）以载体浸泡定量杀菌试验进行消毒效果的测定。按产品使用说明书中的消毒剂作用浓度和作用时间进行试验。
（2）染菌时，将止血钳样本齿面朝上，用0.1mL无菌吸管或移液器将0.02mL菌悬液滴染齿部，涂匀，置37℃恒温培养箱内至干燥。
（3）取无菌平皿，按每个载体10mL用量加入消毒剂，置20℃±1℃水浴中保温5min。 （4）将10个染菌样本浸没于消毒液中进行消毒处理。
（5）作用至规定时间，取出样本，分别移入含10mL中和剂溶液的塑料试管内。在手掌上振打200次，分别取样液1.0mL，以倾注法接种 2 个无菌平皿，放 37℃恒温培养箱培养至规定时间，计数菌落数，作为试验组。
（6）每次试验，以标准硬水代替消毒液，将2个染菌样本以同样条件处理，然后与试验组样本同法进行活菌培养计数，作为阳性对照组，其菌量应在 1310cfu/样本～5310cfu/样本。
（7）将本次试验未用完的同批次中和剂溶液、稀释液、培养基等分别设阴性对照。 （8）以上试验重复3次。 2.2.2.4 评价规定
阴性对照组均无菌生长，阳性对照组菌量达到规定要求，30个试验组样本的微生物杀灭对数值均≥3.00，判定为消毒合格。
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消毒技术规范（2008年版）
