南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2020，51（1）：140-146·140·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com51卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.01.018不同发育期小黄椰胚乳抗氧化酶活性变化规律
李
23
静1，，陈惠慧1，，吴
翼1，杨耀东1，范海阔1，弓淑芳1，刘
410000；3海南省师范大学生命科学学院，海口
蕊1，王仁才2*
571339；570100）
（1中国热带农业科学院椰子研究所/海南省热带油料作物生物学重点实验室，海南文昌
2
湖南农业大学园艺园林学院，长沙
摘要：【目的】研究小黄椰果实发育过程中椰子胚乳的抗氧化能力，为鲜食或加工用椰子果实的筛选提供理论参
考。【方法】在小黄椰果实发育过程中取不同发育期椰子胚乳，分别测定椰子胚乳中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性及过氧化氢（H2O2）和可溶性蛋白含量，分析各指标的变化规律，评价不同成熟度椰子胚乳的抗氧化活性。【结果】液体胚乳的CAT、GR活性和H2O2含量高于固体胚乳，而SOD活性及可溶性蛋白含量低于固体胚乳。果实发育前期，固体胚乳的POD活性高于液体胚乳，而果实发育后期液体胚乳的POD活性高于固体胚乳。不同发育期中11月龄固体胚乳的SOD活性最强，为47.75U/mgFW；而10月龄液体胚乳的POD活性最强，为8.41U/mg；椰子胚乳中GR活力较低，最高仅为4.64U/g，远低于的SOD、POD和CAT活性；6月龄液体胚乳的CAT活性最高，为8.75U/mg。各抗氧化酶活性的相关性分析结果表明，椰子胚乳CAT活性与H2O2含量呈极显著正相关（P<0.01，下同），GR活性与可溶性蛋白含量呈显著负相关（P<0.05，下同）；其中，液体胚乳的CAT活性与可溶性蛋白含量呈显著负相关，固体胚乳的CAT活性与GR活性呈显著正相关。【结论】椰子果实发育前期液体胚乳中的抗氧化酶起关键作用，在果实发育后期则固体胚乳的抗氧化酶逐渐起主导作用。因此，鲜食椰子可选择9月龄前的果实较好，而加工用椰子宜选择9月龄后的椰子果实。
关键词：小黄椰子；胚乳；抗氧化酶；过氧化氢（H2O2）；可溶性蛋白中图分类号：S667.401文献标志码：A文章编号：2095-1191（2020）01-0140-07
Changesofantioxidantenzymeactivitiesinendospermofsmall
yellowcoconutatdifferentdevelopmentalstages
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LIJing1，，CHENHui-hui1，，WUYi1，YANGYao-dong1，FANHai-kuo1，
GONGShu-fang1，LIURui1，WANGRen-cai2*
（1CoconutResearchInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/HainanKeyLaboratoryofTropicalOil
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CropsBiology，Wenchang，Hainan571339，China；Horticulture&LandscapeCollege，HunanAgricultureUniversity，
3
Changsha410000，China；CollegeofLifeSciences，HainanNormalUniversity，Haikou570100，China）Abstract：【Objective】Tostudytheantioxidantcapacityofcoconutendospermduringthedevelopmentofsmallye-llowcoconuts，andtoprovideatheoreticalreferenceforthescreeningoffreshorprocessedcoconutfruits.【Method】Du-ringthedevelopmentofsmallyellowcoconutfruit，coconutendospermatdifferentdevelopmentalstagesweretaken，andthesuperoxidedismutase（SOD）activityandperoxidase（POD）activity，catalase（CAT）activity，glutathionereductase（GR）activity，hydrogenperoxide（H2O2）contentandsolubleproteincontentincoconutendospermweremeasuredre-spectively，analysisofthechangesineachindexandevaluationofthecoconutendospermantioxidantactivityatdifferentmaturitylevelswereconducted.【Result】TheactivitiesofCATactivity，GRactivityandH2O2inliquidendospermwerehigherthanthoseinsolidendosperm，whiletheSODactivityandsolubleproteincontentwerelowerthanthoseinsolidendosperm.Intheearlystageoffruitdevelopment，thePODactivityofsolidendospermwashigherthanthatofliquidendosperm，whileinthelaterstageoffruitdevelopment，thePODactivityofliquidendospermwashigherthanthatofsolidendosperm.TheSODactivityof11-month-oldsolidendospermwasthestrongestatdifferentdevelopmentalstages，whichwas47.75U/mgFW.The10-month-oldliquidendospermhadthestrongestPODactivity，at8.41U/mg；theGRactivityincoconutendospermwaslow，thehighestonewasonly4.64U/g，whichwasfarlowerthantheSOD，PODandCATactivities.The6-month-oldliquidendospermhadthehighestCATactivityat8.75U/mg.Thecorrelationanalysisamongvariousantioxidantenzymesactivitiesshowedthat，therewasextremelysignificantpositivecorrelationbetweenCATactivityandH2O2contentofcoconutendosperm（P<0.01，thesamebelow），andtherewassignificantlynegativecor-收稿日期：2019-04-29基金项目：海南省自然科学基金项目（318QN274）；农业农村部农业国际交流与合作项目（BARTP-06-WFY）作者简介：*为通讯作者，王仁才（1962-），博士，研究员，主要从事猕猴桃采后保鲜研究工作，E-mail：409600160@qq.com。李静
（1981-），主要从事椰子遗传育种研究工作，E-mail：jinghui11111@163.com
1期李静等：不同发育期小黄椰胚乳抗氧化酶活性变化规律
·141·relationbetweenGRactivityandsolubleproteincontent（P<0.05，thesamebelow）.Inliquidendosperm，theCATactivityhadsignificantnegativecorrelationwithsolubleproteincontent，andinsolidendosperm，CATactivityhadsignificantpositivecorrelationwithGRactivity.【Conclusion】Theantioxidantenzymesintheliquidendospermplayakeyroleintheearlystageofcoconutfruitdevelopment，andtheantioxidantenzymesinthesolidendospermgraduallyplayaleadingroleinthelaterstageoffruitdevelopment.Therefore，itisbettertochoosethefruitbefore9monthsofageforfreshcoco-nut，andthecoconutfruitafter9monthsofageforprocessingcoconut.
Keywords：smallyellowcoconut；endosperm；antioxidantenzyme；hydrogenperoxide（H2O2）；solubleproteinFoundationitem：HainanNaturalScienceFoundation（318QN274）；InternationalExchangeandCooperationPro-jectofMinistryofAgricultureandRuralAffairs（BARTP-06-WFY）
0引言
【研究意义】椰子（CocosnuciferaL.）隶属于棕榈科椰子属，被称为“生命之树”（Famurewaetal.，2017；Rogeretal.，2018），其可加工成椰子油、椰子汁、椰子糖、椰子粉、椰雕工艺品及椰棕垫等，给热区人民带来很大的经济利益（Pereraetal.，2007）。椰子的可食部分是其胚乳，椰子水是液体胚乳，椰肉是固体胚乳。不论鲜食还是加工，椰子胚乳的抗氧化活性均为一个重要指标，但椰子胚乳封闭于坚实的椰壳中，目前针对其有氧代谢过程及抗氧化研究较薄弱。因此，研究椰子胚乳抗氧化活性对了解椰子胚乳生长发育及果实健康食用均具有重要意义。【前人研究进展】植物在自身有氧代谢过程中积累的大量超氧阴离子及单线态氧等有毒物质会影响其生长发育（李合生，2002），但在漫长的演化过程中又产生形成了能调控活性氧水平的代谢途径（王鑫，2014），如超氧化物歧化酶（SOD）可解除超氧根阴离子造成的氧化胁迫（Karpinskaetal.，2001），过氧化物酶POD）具有控制植物逆境胁迫下细胞氧化还原平衡及参与延缓植物成熟衰老、生长素降解等功能（Huetal.，2016）。在植物细胞中，谷胱甘肽还原酶（GR）主要存在于叶绿体基质中，植物遭受逆境胁迫时使用外源过氧化氢（H2O2）处理一些植物的种子可有效提高其耐盐性（deAzevedoNetoetal.，2005；Wahidetal.，2007）。在椰子果实发育过程中其胚乳内抗氧化酶也发生明显变化。郑亚军和陈卫军（2009）研究发现天然椰子水对超氧阴离子自由基有较强的清除作用。张观飞等（2017）分析发酵对椰子水抗氧化活性的影响，结果表明低纯度椰子水的抗氧化活性有明显改善。目前，针对新鲜椰肉的抗氧化酶活性研究报道较少，而有关其成分研究也主要集中在椰子油（主要为脂肪酸）的抗氧化活性评价方面。Nevin和Rajamohan（2006）通过给小鼠灌胃原生态椰子油VCO）、椰子油和花生油，结果发现VCO具有较强的抗氧化活性。Nagaraju和Belur（2008）把椰子油、花生油和橄榄油混合灌胃小鼠，结果发现小鼠肝脏
中SOD、CAT、谷胱甘肽转移酶（GST）等酶的活性明显提高。郑亚军等（2010）也研究证实VCO具有较强的DPPH清除能力。因此，研究液体胚乳和固体胚乳中抗氧化酶活性，尤其是不同成熟度椰子胚乳的抗氧化酶活性，不仅有助于了解椰子在遭受环境胁迫时抗氧化活性酶变化规律，还能为椰肉加工的品种筛选提供参考。【本研究切入点】目前，国内外鲜见针对椰子果实发育过程中抗氧化酶活性的研究报道。
拟解决的关键问题】通过测定分析小黄椰不同发育时期液体胚乳和固体胚乳的抗氧化酶（SOD、POD、CAT和GR等）活性，掌握小黄椰胚乳的抗氧化酶变化规律，为椰子抗氧化研究及鲜食或加工用椰子果实的筛选提供理论依据。
1材料与方法
1.1
试验材料
供试椰子品种为小黄椰，取自中国热带农业科学院椰子研究所椰子种质资源圃。椰子在授粉后5~6个月开始形成固体胚乳，为了更具代表性，取样时选择5株结果稳定的成年小黄椰子树为研究对象，对每株椰树上的花序从开花时进行标记，并在花后6个月（2018年6月）开始取样，分别取花后6月龄（6M）、花后7月龄（7M）、花后8月龄（8M）、花后9月龄9M）、花后10月龄（10M）和花后11月龄（11M）的椰子果实。6M和7M两个时期的椰子肉含量较少，因此采样时每次取5个椰果为材料，而其余时期各取3个椰果作为生理性重复。主要试剂：磷酸二氢钾（广州化学试剂公司），磷酸二氢钠（广州化学试剂公司）；SOD、POD、CAT、GR和H2O2等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。主要仪器设备：高速离心机（Eppendorf5801R型，德国艾本德公司）、恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）和紫外分光光度计（日本岛津公司）。1.2试验方法
剖开椰子果后分别取100.0mL液体胚乳及不同部位的固体胚乳混合后作为试验材料，液氮速冻后置于超低温冰箱保存备用。由于1.0mL液体胚乳的（（【（·142·南方农业学报51卷重量为1.0g，为统一计算单位，因此在提取各活性酶时分别取1.0mL液体胚乳和1.0g固体胚乳，在换算酶活性时均以重量计算后再比较酶活性差异。
1.2.1胚乳SOD和POD活性测定称取1.0g固体胚乳，用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.1）按重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例提取，液体胚乳按体积（mL）∶体积（mL）=1∶9的比例在冰浴条件下提取，3500r/min离心10min后分别取35μL液体胚乳提取上清液、20μL固体胚乳提取上清液，按照操作说明测定SOD活性。各取上述液体胚乳和固体胚乳的上清液100μL，按照POD试剂盒操作说明测定POD活性。
1.2.2胚乳可溶性蛋白含量测定取1.0g固体胚乳，用5%生理盐水按重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例，液体胚乳按照体积（mL）∶体积（mL）=1∶9的比例在冰浴条件下提取可溶性蛋白，3500r/min离心10min后取50μL上清液，根据操作说明测定椰子胚乳的可溶性蛋白含量。
1.2.3胚乳GR活性测定提取方法与SOD提取方法相同。10000r/min离心10min后分别吸取20μL椰子胚乳提取上清液，按照操作说明测定GR活性。1.2.4胚乳CAT活性和H2O2含量测定提取方法与SOD提取方法相同。10000r/min离心10min后分别取50和100μL上清液，按照操作说明测定椰子胚乳的CAT活性和H2O2含量。1.5统计分析
试验数据采用SAS9.1进行数理统计，并以Dun-can’s新复极差法进行多重比较。
2结果与分析
2.1
小黄椰发育过程中果实的变化情况由表1可知，在小黄椰子果实发育过程中，椰果各部位随着果实的成熟呈现一定变化规律，其果肉厚度逐渐增加，椰子水含量逐渐减少，椰子果实重量逐渐减轻。椰子果实大小（纵径和横径）变化差异不显著（P>0.05，下同），因为从6M开始椰子果实已基
表1小黄椰发育过程中果实的变化情况
Table1Fruitchangesduringthedevelopmentofyellowcoconut
椰果部位
Partofcoconut果实纵径（cm）Longitudinaldiameter果实横径（cm）Transversediameter果肉厚度（cm）Pulpthickness果实重量（kg）Fruitweight椰子水含量（mL）Coconutwatercontent
6M
16.1±0.4b14.2±0.50.1±0.0e1.2±0.2b367±19a
本发育完成，不会随着植株发育而明显变大。椰子在6M时其果实厚度平均仅0.1cm，此时椰肉无法完全覆盖椰壳内部，在随后的发育过程中椰肉逐渐覆盖整个椰壳，椰肉也逐渐增厚，至果实成熟时（10M和11M）椰肉厚度达1.1cm，此时与其余各时期的椰肉厚度存在显著差异（P<0.05，下同）。椰子水随着果实的成熟逐渐减少，即从6M时的367mL下降到成熟时（11M）的205mL，椰子水从充满整个椰腔变成仅占椰腔的一部分。6M和7M时的椰子水含量差异不显著，但从9M开始椰子水含量显著降低。由此可见，在椰子果实发育至逐渐成熟的过程中，椰子水与椰肉间密切关联，其物质之间存在相互转化的关系。2.2椰子果实发育过程中胚乳SOD的活性变化
由图1可知，不同发育期液体胚乳的SOD活性均明显低于固体胚乳。其中，液体胚乳的SOD活性随着果实的成熟整体上呈逐渐下降趋势，在6M时最强，为11.02U/mgFW，而后下降，至成熟时（10M~11M）为8.20U/mgFW；液体胚乳在6M~9M时的SOD活性差异不显著，从10M时开始差异显著。而固体胚乳的SOD活性呈两头高中间低的变化趋势，6M的较高，可达44.26U/mgFW，在7M时有所下降，8M时有所回升，而后又下降，至10M达最低值，为30.57U/mgFW，随后又升高；至11M时SOD活性最强，为47.75U/mgFW，与7M~10M时固体胚乳中SOD活性差异显著。可见，在整个椰子果实发育期，固体胚乳的SOD起主导作用。
2.3椰子果实发育过程中胚乳POD的活性变化
从图2可看出，随着果实的发育，液体胚乳的POD活性呈先升高后下降的变化趋势，在10M时达最高值，为8.41U/mg，与其他发育时期液体胚乳的POD活性存在显著差异；6M时液体胚乳POD活性最低，仅为3.03U/mg。果实发育前期（6M~8M），固体胚乳的POD活性高于液体胚乳，果实发育后期（9M~11M）固体胚乳的POD活性低于液体胚乳；花后9M时固体胚乳POD活性最强，为5.60U/mg，但与6M、8M和10M时固体胚乳POD活性差异均不显著。
7M16.6±0.2ab13.7±0.80.3±0.1d1.3±0.1a352±20a
发育时期Developmentperiod
8M9M16.9±0.2a16.5±0.4ab13.9±0.613.7±0.20.5±0.0c0.8±0.0b1.02±0.0cd0.8±0.1d326±26ab294±15bc
10M
17.0±0.4a14.1±0.31.1±0.1a0.7±0.1e263±12c11M17.1±0.4a14.0±0.41.1±0.0a0.64±0.0e205±15d
同行数据后不同小写字母表示不同发育时期间差异显著（P<0.05）
Differentlowercaselettersinthesamerowindicatedsignificantdifferencebetweendifferentdevelopmentalstages（P<0.05）
不同发育期小黄椰胚乳抗氧化酶活性变化规律
