植物总DNA的提取、电泳检测及PCR扩增95
一、实验目的
1. 理解用CTAB法提取植物组织DNA的原理,掌握CTAB法提取植物组织DNA
的方法。
2. 学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法,理解PCR基因扩增在分子生物实
验技术中的重要性。
3.了解引物设计的一般要求。
二、实验原理copy后要修改
由于植物细胞含有细胞壁及其细胞内高含量的多糖物质,因此一般的提取真核细胞基因组DNA的方法用在植物细胞上并不十分有效。十六烷基三甲基溴化铵(cetyltriethy lammonium bromide, CTAB)法是常用的提取植物细胞基因组DNA的方法。CTAB是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)时,CTAB-核酸复合物是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB-核酸复合物与蛋白质、多糖类物质分开。CTAB-核酸复合物再用70 -75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
植物DNA的提取程序应包括以下几项:①必须破碎或消化细胞壁释放出细胞内容物;②必须破坏细胞膜及核膜,使DNA释放到提取缓冲液中,常用CTAB一类的去污剂使细胞膜崩解;③DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质,可利用氯仿、RNase等除去。一旦DNA释放出来,其剪切破坏的程度必须要降到最低。
CTAB法提取植物DNA,方法比较简单,适用于大多数植物。虽然得到的DNA纯度不是很高,但仍能满足限制性内切核酸以单链DNA为模板,4种dNTP 为底物,在模板3’末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中,加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热,使模板DNA在高温下变性,双链解开为单链状态;然后降低溶液温度,使合成引物
在低温下与其靶序列配对,形成部分双链,称为退火;再将温度升至合适温度,在Taq DNA聚合酶的催化下,以dNTP为原料,引物沿5’→3’方向延伸,形成新的DNA 片段,该片段又可作为下一轮反应的模板,如此重复改变温度,由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,反复循环,使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
三、实验材料、试剂和仪器
1. 材料新鲜的植物组织(如幼叶、花器、幼根)或-80℃冻存的材料。仪器、
用具:离心机、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、pH 计、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪、电泳槽、微量移液器及吸头,硅烷化的PCR小管,PCR扩增仪(PTC-100),台式高速冷冻离心机等。
2. 试剂
(1)2×CTAB缓冲液100ml(见改进的CTAB提取植物DNA方法):
各试剂用量重新计算
(2)β-巯基乙醇;70%乙醇;异丙醇
(3)氯仿/异戊醇(24:1,v/v):将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀,置棕
色瓶中,4℃保存。
(4)5×TBE 电泳缓冲液(pH8.0)(1L):Tris 54g;硼酸27.5g;Na2EDTA·2H2O
3.72g。用pH计测定。临用前稀释至0.5×TBE 电泳缓冲液
(5)6×上样缓冲液:0.25%溴酚兰、40%蔗糖
(6)10×EX Taq Buffer (Mg2+ plus) ;dNTP Mixture (各2.5 mM) TaKaRa EX Taq
聚合酶5U/μl
(7)模板DNA (已预先稀释);上、下游引物混合物(已预先稀释)
四、实验步骤
(一)植物DNA提取
1.在5 mL离心管中,加入800 μl的2×CTAB, 65℃预热。用前加入20 μl β-巯基
乙醇。
2.取嫩的组织材料1.0 g,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,
用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中,充分混匀后置65℃水浴中保温45-60min,并不时轻轻转动试管。
3.加等体积的氯仿/异戊醇,轻轻地颠倒混匀,室温下10 000rpm离心10 min,
0植物DNA的提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳-1225050026高丽
