Notch1信号通路对人牙周膜干细胞应力分化过程的调控

Notch1信号通路对人牙周膜干细胞应力分化过程的调控

周述作1，秦 凡1，崔嘉玺1，董 立2，周继祥1

【摘 要】[摘 要] 目的 探究Notch1信号通路在人牙周膜干细胞(PDLSCs)应力分化过程中的调控作用。方法 体外分离培养鉴定PDLSCs，以化学药物方式调控Notch1通路；进行体外细胞应力试验并检测Notch1通路关键指标Notch蛋白胞内段(NICD)以及早期成骨标志物碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白2(BMP2)。应力参数为形变率0～12%，频率0.1 Hz；加载时间分组为0 h、6 h、12 h、24 h。结果 激活Notch1通路，ALP、BMP2的表达呈下降趋势(P<0.05)；抑制Notch1通路，ALP、BMP2的表达水平随加力时间明显升高(P<0.05)。结论 激活Notch1信号通路将抑制人PDLSCs应力分化。 【期刊名称】局解手术学杂志 【年(卷),期】2017(026)004 【总页数】4

【关键词】[关键词] Notch1;人牙周膜干细胞;Jagged1;DAPT;动态张应力;成骨分化 ·基础研究·

人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是从人牙周膜组织分离培养出的一种位于口腔特殊位置的间充质干细胞[1]。在体内体外实验中PDLSCs具有较强的自我更新能力和成骨分化潜能，在牙周组织行使正常功能和自我修复过程中起着重要作用[2]。常慧君等[3]研究显示，动态张应力作用下PDLSCs可向成骨细胞分化，但未对分化早期过程中的具体调控通路进行研究。Notch1信号通路是一种进化上高度保守的细胞间信号通路，在间充质干细胞

分化时有显著调控作用[4]。Notch1信号通路由Notch1跨膜受体与一组配体蛋白组成，其中Jagged1配体蛋白在人类体内最为重要。Notch1跨膜受体与位于另一细胞膜表面Jagged1配体蛋白结合，通过γ外分泌酶剪切释放Notch1通路关键蛋白(Notch intracellular domain，NICD)激活Notch1通路[5]。本实验通过激动剂人重组

Jagged1蛋白(Jagged1)，抑制剂γ外分泌酶抑制剂(DAPT)上、下调NICD，研究动态张应力作用下Notch1信号通路参与PDLSCs成骨的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料和设备

α-MEM培养液，胎牛血清；0.25%胰蛋白酶(HyClone公司，美国)，Ⅰ型胶原酶(HyClone公司，美国)，PBS(中杉金桥生物技术有限公司，北京)，成骨诱导培养液、成脂诱导培养液、茜素红、油红O(Cyagen公司，美国)，FX-4000T 张应力加载系统(Flexcell International Corporation，美国)，倒置相差显微镜(Olympus，日本)，CO2孵箱(Themo Scientific，美国)，水平电泳槽(北京君意东方仪器公司)，DG-Ⅲ双稳数显电泳仪(北京鼎国生物技术发展中心)，高速离心机(Sigma，美国)。 1.2 PDLSCs的分离培养和鉴定

临床选取牙体牙周均健康且年龄为14～20岁患者拔除的新鲜正畸牙，以含2%双抗PBS反复冲洗至澄清。自龈向根方向刮取根中1/3牙周膜组织，确保组织块小于1 mm2，加入Ⅰ型胶原酶消化45 min，1 000 rpm离心，去上清后制悬，接种于6孔板。37 ℃、5%CO2培养箱中培养。48 h后首次换液2 mL，以后每2 d换液。待融合率达80%时传代，取第2代PDLSCs以有限稀释法分

选，分选后传至第4代。免疫组化染色：取第4代PDLSCs爬片，PBS洗涤后4%多聚甲醛固定20 min，免疫组织化学Envision法角蛋白、波形蛋白染色鉴定细胞来源，激光共聚焦显微镜观察。PDLSCs成骨成脂诱导分化:收集第4代PDLSCs计数并制悬，以每孔细胞约2×104接种于24孔板内，孔底预置无菌玻片。待融合率至90%时分别按说明书更换为成骨、成脂诱导培养液，并定期换液。14 d后结束诱导，多聚甲醛固定后分别以茜素红和油红O染色，光镜下观察。

1.3 PDLSCs动态张应力加载

以第4～6代PDLSCs制悬计数，按约2×106/孔接种于BioFlex硅胶膜6孔培养板内。采用FX-4000T加载装置进行动态张应力加载，应力参数为:波型为正弦波，形变率0～12%，频率为0.1 Hz。研究显示此参数最为接近临床正畸加力，且能显著促进PDLSCs成骨分化[6]。重组人Jagged1蛋白采用文献[7]报道的浓度10 ng/L，DAPT根据说明书建议采用10 μmol/L。实验分为4批进行，每批均设4个组：对照组、DMSO组、DAPT组及Jagged1组，每组设4个孔。细胞融合达80%以上时，将孔内培养液更换为无血清的α-MEM培养液，进行同步化处理。12 h后将各孔内无血清的α-MEM培养液更换为成骨诱导液，实验组各孔内分别加入DAPT及Jagged1，DMSO组加入溶剂DMSO，使其终浓度为10-2 mol/L，空白组只加入成骨诱导液。4批细胞分别连续加载6 h、12 h、24 h及一个不加力对照组。 1.4 细胞早期成骨分化标志物检测

PDLSCs分别连续加载6 h、12 h、24 h，加力程序完成后即刻提取加力组及空白对照组总蛋白，按标准Western blot方法检测其中NICD、ALP以及