第29卷第5期2020年10月
中国组织化学与细胞化学杂志
CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY
Vol.29.No.5October.2020
下调miR-27通过靶向PTPN9抑制胃癌细胞增殖、
迁移和侵袭
翟学敏*，徐郑玉，刘象，李聪丽
（三门峡市中心医院消化内科，三门峡 472000）
〔摘要〕目的 探索下调miR-27对胃癌（gastric cancer，GC）细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其相关机制。方法 用RT-qPCR法检测GC病理组织、癌旁正常组织、GC细胞和正常胃粘膜细胞中miR-27的表达。将miR-27抑制剂转入胃腺癌细胞系AGS细胞后，分别用MTT法、EdU法、划痕法和Transwell法检测细胞活力、增殖、迁移和侵袭；Western blot检测非受体型蛋白络氨酸磷酸酶9（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9，PTPN9）的表达；用荧光素酶报告基因测定法确定miR-27 对PTPN9编码基因的3’-非翻译区（3’-UTR）的靶向作用。结果 在GC组织和细胞中miR-27表达上调，PTPN9表达下调。抑制miR-27表达能降低AGS细胞增殖、迁移和侵袭，促进PTPN9表达。结论 下调miR-27通过靶向调节PTPN9表达来抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭。
〔关键词〕miR-27；PTPN9；胃癌
〔中图分类号〕R365 〔文献标识码〕A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2020. 05. 006
Down-regulation of miR-27 inhibits proliferation, migration and invasion of gastric
cancer cells by targeting PTPN9
Zhai Xuemin, Xu Zhengyu, Liu Xiang, Li Congli
(Department of Gastroenterology , Sanmenxia Central Hospital, Sanmenxia 472000, China)
〔Abstract〕Objective To explore the effects of down-regulation of miR-27 on proliferation, migration and invasion of gastric cancer (GC) cells and its related mechanisms. Methods The expression of miR-27 in GC tissues, normal tissues, GC cells and normal gastric mucosal cells were detected by RT-qPCR. After miR-27 inhibitor was transfected into gastric cancer cell line AGS cells, the cell viability, proliferation, migration and invasion were detected by MTT, EdU, wound scratch and Transwell assays, respectively; The expression of protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9 (PTPN9) was detected by Western blot; Luciferase reporter assay was used to determine whether miR-27 targeted the 3’ -untranslated region (3’-UTR) of the PTPN9 coding gene. Results miR-27 expres-sion was up-regulated and PTPN9 expression was down-regulated in GC tissues and cells. Inhibition of miR-27 expression reduced the proliferation, migration and invasion and promoted the expression of PTPN9 of AGS cells. Conclusion Down-regulation of miR-27 inhibits proliferation, migration and invasion of GC cells by targeting PTPN9.
〔Keywords〕miR-27; PTPN9; gastric cancer
*
GC）胃癌（gastric cancer，是世界上最常见的恶性消化系统肿瘤之一，其在我国和日本具有较高的发病率[1]。尽管在过去十年中已对GC做过大量的临床与基础方面的研究，但其疗效仍不太理想[2]。越来越多的证据表明，肿瘤组织中存在大量异常表达的MicroRNAs (miRNAs)，异常表达的miRNAs可能是潜在的肿瘤诊断或治疗的生物标志物[3]。miR-27基
因位于19号染色体上，在胰腺癌[4]、乳腺癌[5]、食管癌[6]和肾细胞癌[7]等多种肿瘤中发挥促肿瘤因子作用。另外，在GC中，miR-27可能参与调节GC细胞增殖和分化程度[8, 9]，其对GC进展的具体作用以及分子机制仍不清楚。因此，本实验主要研究下调miR-27对GC细胞增殖、迁移与侵袭的影响并探索潜在的机制。
材料和方法
〔收稿日期〕2020-05-08 〔修回日期〕2020-10-09
翟学敏，女（1981年），汉族，副主任医师，硕士〔作者简介〕
*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：2873762243@qq.com
1 标本来源
选取2017年1月至2018年12月期间三门峡市中心医院病理科的手术切除的10例GC组织和配对
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的癌旁正常组织样本。临床资料显示，GC患者均为首次确诊且未进行过放疗、化疗和生物治疗；年龄范围：39~64岁，平均年龄（48.5±6.8）岁；WHO分型：4例乳头状腺癌、3例管状腺癌和3例粘液腺癌；T分期：6例T2期和4例T3期。病理组织样本使用的方案均经本院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。2 细胞系与主要试剂
人正常胃黏膜细胞系（GES-1）和胃腺癌细胞系（AGS）购自中国科学院上海细胞库；miR-27抑制剂（miR-27 inhibitor）和miRNA阴性对照（miRNA negtive control，miR-NC）由上海吉玛制药技术有限公司合成；miR-27和U6引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和青霉素/链霉素双抗溶液购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司；TRIzol试剂和pMIR-Report质粒购自美国Ambion公司；AMV逆转录酶和SYBR Green qPCR试剂盒购自日本Takara Bio株式会社大连宝生物工程有限公司；茎环RT引物购自美国Applied Biosystems公司；MTT试剂盒购自美国Sigma公司；EdU细胞增殖试剂盒和DAPI试剂购自广州锐博生物技术有限公司；荧光素酶测定试剂盒购自美国Promega公司；PTPN9抗体（MAB2668）购自美国R＆D Systems公司；小鼠抗GAPDH抗体（sc-47724）购自美国Santa Cruz公司；PMSF试剂、RIPA裂解液、ECL发光液、BCA蛋白定量试剂盒和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）购自上海碧云天生物科技有限公司。3 细胞培养与转染
将GES-1和AGS细胞维持在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5％CO 2的培养箱中培养。取对数期AGS细胞接种到6孔板（5×105个/孔），待细胞约70%汇合时，用Lipofectamine 2000试剂分别转染75nmol/L miR-NC或miR-27 inhibotor，转染24h后收集细胞用于后续实验。
4 RNA提取和RT-qPCR
用TRIzol试剂从细胞或组织样本中提取总RNA，总RNA经光度计（Eppendorf AG，德国）定量
后，用AMV逆转录酶和茎环RT引物将2μl（0.5μg/μL）的总RNA逆转录成cDNA。然后根据SYBR Green qPCR试剂盒说明书步骤，取各样本cDNA和目的基因引物在7500荧光定量PCR系统（Applied Biosyste-ms，美国）进行RT-qPCR反应。引物序列（5’-3’）为：miR-27（正向）CGCCTTGAATCGGTGACACTT，miR-27（反向）GGCAAGTGTCACCGATTCAAG；U6（正向）GCTTCGGCAGCACATATACTAT，U6（反向）CGCTTCACGAATTTGCGTGCAT。反应条件为：95℃温育5min，然后进行40个循环（95℃ 30s，55℃30s和72℃ 30s），接着熔融1个循环。所有反应均一式三份进行。当反应完成时，以U6为参照，用2-??Ct法计算各样本miR-27的表达量。5 MTT检测细胞活力
取已转染miR-NC或miR-27 inhibitor的AGS细胞接种到96孔板（5000个/孔），分别培养1~4d，然后在指定处理时间点时加入20μl MTT试剂5mg/ml），并将细胞在37℃下再孵育4h，然后加入
150μl DMSO。在室温下震摇10min后，用Multiskan FC酶标分析仪（Thermo Scientific，美国）在570nm处测定光密度（OD）值，并绘制生长曲线。6 EdU检测细胞增殖
取已转染miR-NC或miR-27 inhibitor的AGS细胞接种到48孔板（5×105个/孔），加入100μl EdU试剂（50μmol/l）在37℃下孵育8h，然后用4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗3次，用0.5% Triton X-100透化3min，PBS再次洗3次，用Apollo反应液在室温避光染色30min，PBS洗涤后用DAPI染核5min。通过Olympus IX83荧光显微镜拍照细胞图像并计数EdU阳性细胞。
7 划痕实验检测细胞迁移
取已转染miR-NC或miR-27 inhibitor的AGS细胞接种到6孔板（5×105个/孔），待细胞汇合时，用200μl移液管尖端刮擦汇合的单层细胞，然后用PBS洗涤以清除细胞碎片和悬浮细胞，并更换新鲜的无血清培养基并继续培养细胞24h。用光学显微镜在两个时间点（0和24h）拍摄细胞图像。用Image J软件测量划痕愈合面积。8 Transwell实验检测细胞侵袭
用Transwell小室（8μm孔径，基质胶薄层包被
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聚酯透明膜；BD Biosciences，美国）进行细胞侵袭测定。取已转染miR-NC或miR-27 inhibitor的AGS细胞，分别用无血清DMEM培养基重悬后，调整细胞密度（5×104个/ml）。取100μl细胞悬液加入上室，取0.5mL含10％FBS的DMEM培养基加入下室；培养24h。在培养结束时，用棉签擦除滤膜上表面的细胞，用4％多聚甲醛在室温下固定滤膜下表面的细胞15min，然后用PBS洗涤细胞3次，并在室温下用0.1％结晶紫染色15min。在光学显微镜（Olympus，日本）下观察并计数侵袭的细胞。9 miR-27靶基因的预测
用TargetScan（http://www.targetscan.org/）、Pic-Tar（http://www.pictar.org/）和miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）靶基因预测软件预测miR-27的潜在靶标，3项软件的预测结果均包含PTPN9。
10 双荧光素酶测定
将携带具有预测的miR-27潜在结合位点的PT-PN9野生型（WT）和突变型（Mut）的3’-UTR扩增，并将扩增的片段克隆到pMIR-Report质粒中。用Lipofectamine 2000将WT或Mut质粒以及miR-NC和miR-27 inhibitor转入293T细胞，继续培养24h。用双荧光素酶测定试剂盒按说明书步骤测定报告基因的相对荧光活性。11 蛋白质提取和蛋白质印迹
用PBS冲洗细胞，然后加入含1% PMSF的RIPA裂解液，在冰上裂解30min后，在4℃下用1.6×105g离心10min并收集上清液。上清液用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度后，每个样品取40μg蛋白进行Western blot电泳，并将电泳后的蛋白经电转至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭蛋白1h，然后室温孵育PTPN9（1:1000）和GAPDH（1:5000）抗体1.5h，TBST洗膜3次后，再室温孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（1:2000）1h。TBST洗膜3次后，用ECL发光液显影条带，并用Image J软件测定条带的光密度值。12 统计学分析
数据采用平均值±标准差（`x ± s）表示，数据的比较使用SPSS 18.0软件Student’s t检验法进行统计学分析，若P <0.05则认为数据的差异具有统计学意义。
结 果
1 miR-27在GC病理组织和胃癌细胞系中表达
上调
RT-qPCR结果显示，miR-27在GC组织或AGS细胞中的表达水平明显高于癌旁正常组织或GES-1细胞（图1A、B），提示miR-27在GC组织和细胞中表达上调。miR-NC或miR-27 inhibitor转染AGS细胞后，相对于miR-NC转染的细胞，miR-27 inhibitor转染的细胞中miR-27的表达水平明显降低（图1C），说明转染成功，后续实验均采用此构建的转染细胞。
2 下调miR-27抑制AGS细胞增殖
miR-NC或miR-27 inhibitor转染AGS细胞后，MTT（图2A）和EdU（图2B）分析显示，相对于miR-NC转染的细胞，转染miR-27 inhibitor的细胞的活力和EdU阳性细胞百分比均明显降低，说明下调miR-27能抑制AGS细胞增殖。3 下调miR-27抑制AGS细胞迁移与侵袭
miR-NC或miR-27 inhibitor转染AGS细胞24h后，划痕（图3A）和Transwell（图3B）实验分析显示，相对于miR-NC转染的细胞，miR-27 inhibitor转染的细胞的划痕愈合面积和侵袭细胞数均明显降低，说明下调miR-27能抑制AGS细胞迁移与侵袭。4 miR-27靶向调控PTPN9
Western Blot检测GES-1和AGS细胞中PTPN9的表达显示：与GES-1细胞比较，AGS细胞中PT-PN9的表达水平明显降低（图4A）。用miR-NC或miR-27 inhibitor转染AGS细胞后，相对于miR-NC转染的细胞，miR-27 inhibitor转染的细胞中PTPN9的表达水平明显增加（图4B）。靶基因预测软件显示PTPN9 3’-UTR中具有miR-27的结合序列（图4C左）；进一步通过双荧光素酶报告基因测定显示PTPN9是miR-27的靶标（图4C右）。
讨 论
研究GC的发病与进展机制有助于对GC的诊断与治疗提供更多的参考策略。近年来已经证明，miRNAs参与包括胃癌在内的多种肿瘤的发展，其在肿瘤中可作为肿瘤抑制因子或促进因子发挥作用[8-11]。过去的研究报道，miR-27在多种肿瘤中表
第5期翟学敏等.下调miR-27通过靶向PTPN9抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭 431
图1 病理组织和细胞系中miR-27表达水平的RT-qPCR检测A，GC组织和匹配的癌旁正常组织中miR-27相对表达水平统计学分析（***P<0.001；n=10）；B，GES-1和AGS细胞中miR-27相对表达水平统计学分析（***P<0.001；n=8）；C，转染miR-27 inhibitor后AGS细胞中miR-27相对表达水平统计学分析（***P<0.001；n=8）
Fig.1 RT-qPCR analysis for expression levels of miR-27 in pathological tissues and cell lines. A, statistical analysis for relative expression levels of miR-27 in gastric cancer tissues and matched adjacent normal tissues (***P<0.001; n=10); B, statistical analysis for relative expression levels of miR-27 in GES-1 and AGS cells (***P<0.001; n=8); C, statistical analysis for relative expression levels of miR-27 in AGS cells after transfection with miR-27 inhibitor (***P<0.001; n=8)
图2 下调miR-27对AGS细胞增殖的影响。A，AGS细胞活力的MTT法检测；B和C，AGS细胞增殖的EdU法检测与统计学分析（比例尺=50μm）；与NC组比较：*0.01 Fig.2 Effect of down-regulation of miR-27 on proliferation of AGS cells. A, cell viability detected by MTT assay in AGS cells; B and C, EdU detection and statistical analysis for proliferation of AGS cells (scale bar = 50μm); *0.01 图3 下调miR-27对AGS细胞迁移和侵袭的影响。A，划痕法检测细胞迁移能力与统计学分析（比例尺=250μm）；B，Transwell法检测细胞侵袭能力与统计学分析（比例尺=100μm）；与NC组比较：**0.001 Fig.3 Effect of down-regulation of miR-27 on migration and invasion of AGS cells. A, scratch healing assay and statistical analysis of cell migration ability (scale bar=250μm); B, Transwell analysis and statistical analysis of cell invasive ability (scale bar=100μm); **0.001 432中国组织化学与细胞化学杂志 第29卷 图4 miR-27靶向PTPN9分析。A，GES-1和AGS细胞中PTPN9水平比较的代表性Western blot检测结果与统计学分析；B，抑制miR-27表达对蛋AGS细胞中PTPN9水平影响的代表性Western blot检测结果与统计学分析；C，PTPN9-3’UTR与miR-27结合位点（左）和双荧光素酶报告基因分析结果（右）；与对照组比较：**0.001 Fig. 4 Analysis for miR-27 targeting PTPN9. A, representative results and statistical analysis for comparison of PTPN9 levels in GES-1 and AGS cells detected by Western blot; B, representative results and statistical analysis for effect of inhibition of miR-27 expression on levels of PTPN9 in AGS cells detected by Western blot; C, the binding site of PTPN9-3’UTR and miR-27 (left panel), and the results of dual-luciferase reporter assay (right panel); ** P<0.01,***P<0.001 vs GES-1 cells or NC group; n=8 达失调。如，miR-27可通过诱导上皮-间质转化促进胃癌细胞转移[11]；miR-27在人浸润性乳腺癌中显著上调，其表达上调与患者不良预后呈正相关[12]；上调miR-27可促进甲状腺癌细胞迁移，侵袭和血管生成[13]。但miR-27对胃癌的生物学作用和机制在很大程度上依然未知。在本研究中，我们发现miR-27在胃癌组织和细胞中显著上调，而下调miR-27能抑制胃癌AGS细胞的增殖、迁移和侵袭，提示抑制miR-27可能是潜在的胃癌治疗策略。 miRNA是一类小的内源性非编码调节RNA（约19~25个核苷酸），且其可通过与靶标mRNA的3’-非翻译区（UTR）结合来发挥生物学作用。本研究证明PTPN9是miR-27的靶标。PTPN9蛋白在多种肿瘤中低表达，且其低表达程度与肿瘤的不良预后呈正相关 [14, 15] 参 考 文 献 [1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin, 2019, 69(1): 7-34. [2] Tsai MC, Wang CC, Lee HL, et al. Health disparities are associated with gastric cancer mortality-to-incidence ratios in 57 countries. World J Gastroenterol, 2017, 23(44): 7881-7887. [3] Zhang H, Qu Y, Duan J, et al. Integrated analysis of the miR-NA, gene and pathway regulatory network in gastric cancer. Oncol Rep, 2016, 35(2): 1135-1146. [4] Ma Y, Yu S, Zhao W, et al. miR-27a regulates the growth, colony formation and migration of pancreatic cancer cells by targeting Sprouty2. Cancer Lett, 2010, 298(2): 150-158.[5] Guttilla IK, White BA. Coordinate regulation of FOXO1 by miR-27a, miR-96, and miR-182 in breast cancer cells. J Biol Chem, 2009, 284(35): 23204-23216. [6] Wu XZ, Wang KP, Song HJ, et al. MiR-27a-3p promotes esophageal cancer cell proliferation via F-box and WD re-peat domain-containing 7 (FBXW7) suppression. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(9): 15556-15562. 。且已有文献 [16] 表明，上调PTPN9 蛋白表达能抑制GC细胞增殖、迁移与侵袭。我们也发现，下调miR-27能促进PTPN9蛋白表达。由此提示，下调miR-27对GC细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用可能其上调PTPN9来实现。 第5期翟学敏等.下调miR-27通过靶向PTPN9抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭 433 [7] Peng H, Wang X, Zhang P, et al. miR-27a promotes cell pro-liferation and metastasis in renal cell carcinoma. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(2): 2259-2266. [8] Zhao X, Yang L, Hu J. Down-regulation of miR-27a might inhibit proliferation and drug resistance of gastric cancer cells. J Exp Clin Cancer Res, 2011, 30(1): 55. [9] Yang Q, Jie Z, Ye S, et al. Genetic variations in miR-27a gene decrease mature miR-27a level and reduce gastric can-cer susceptibility. Oncogene, 2014, 33(2): 193-202.[10] Rupaimoole R, Slack FJ. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov, 2017, 16(3): 203-222. [11] Zhang Z, Liu S, Shi R, et al. miR-27 promotes human gastric cancer cell metastasis by inducing epithelial-to-mesenchy-mal transition. Cancer Genet, 2011, 204(9): 486-491.[12] Tang W, Zhu J, Su S, et al. MiR-27 as a prognostic marker for breast cancer progression and patient survival. Plos One, 2012, 7(12): e51702. [13] Wang YL, Gong WG, Yuan QL. Effects of miR-27a up-regulation on thyroid cancer cells migration, invasion, and angiogenesis. Genet Mol Res, 2016, 15(4): gmr15049070.[14] Hu B, Yan X, Liu F, et al. Downregulated expression of PTPN9 contributes to human hepatocellular carcinoma growth and progression. Pathol Oncol Res, 2016, 22(3): 555-565. [15] Ma X, Shi W, Peng L, et al. MiR-96 enhances cellular pro-liferation and tumorigenicity of human cervical carcinoma cells through PTPN9. Saudi J Biol Sci, 2018, 25(5): 863-867. [16] Liu Z, Sun F, Hong Y, et al. MEG2 is regulated by miR-181a-5p and functions as a tumour suppressor gene to sup-press the proliferation and migration of gastric cancer cells. Mol Cancer, 2017, 16(1): 133.
下调miR-27通过靶向PTPN9抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭 - 图文
