结合单酶切位点的融合PCR技术对SCN1A基因的定点诱变

结合单酶切位点的融合PCR技术对SCN1A基因的定点诱变

龙跃生;蔡阳林;赵绮华;廖卫平

【摘 要】目的:利用结合单酶切位点的融合PCR技术对癫痫相关基因SCNIA进行定点突变.方法:首先设计两对引物PF1/PR1和PF2/PR2,PF1和PR2均位于突变位点最近的单酶切位点处,而突变位点设计在第一对反向引物(PR1)和第二对正向引物上(PF2).通过重叠延伸法两次PCR扩增:第一次用PF1/PR1和PF2/PR2分开扩增,以扩增产物作模板,PF1/PR2作引物进行融合PCR,得到的扩增产物即含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pMD18-T载体,经测序筛选阳性克隆.结果:DNA测序表明SCN1A基因所编码的第946位密码子由精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His),再通过酶切和连接反应将重组质粒上的突变片段替换SCN1A表达质粒上的对应片段,成功构建了SCN1A突变载体.结论:与现在常用的长距离PCR定点诱导突变相比较,结合单酶切位点的融合PCR定点突变技术具备扩增距离短的优点,大大降低了自发突变的概率,适合于大肠杆菌中易自发突变的较大载体的定点诱变. 【期刊名称】《激光生物学报》 【年(卷),期】2008(017)006 【总页数】5页(P824-828)

【关键词】融合PCR;定点诱变;SCNIA;癫痫 【作 者】龙跃生;蔡阳林;赵绮华;廖卫平

【作者单位】广州医学院第二附属医院神经科学研究所,广东,广州,510260;广州医学院第二附属医院神经科学研究所,广东,广州,510260;广州医学院第二附属医院神