4．(3)G6PDH—Li的交联 将酶—底物溶液置于冰浴中，在搅拌条件下，每隔10~15分钟向此酶液中缓慢加入一定量(25ul，50ul，100ul……)的Li—MA溶液，反应10~15分钟后，分别取出反应液5u1测定酶活性及Li半抗原的抗体对标记酶活性的抑制率.直至加入Li—MA的量所引起酶活性的下降程度最低，而抗体对酶活性的抑制率又最高 时，此标记过程即完成(表2—8) 5．表2—8 G6PDH—Lidocaine交联反应中酶活性变化及抗体抑制率 3.碳化二亚胺法(EDC)制备人工抗原 4.最近几年，在对无免疫原性小分子物质的化学免疫研究中，采用碳化二亚胺作为交联剂制备合成人工抗原的工作愈来愈多，因为用这种试剂进行交联最为方便，除交联的一方作为载体的蛋白质，具有多个氨基或羧基外，不少小分于化合物也具有此反应基团，或通过化学修饰引入羧基。因此，EDC交联法已被广泛应用，并为大家所熟悉。然而，在实践过程中，也遇到不少问题，给相关研究带来不少困难，以下就有关问题略加讨论。 5.使用EDC试剂进行化学交联虽然非常方便，但它除具有同型双功能交联剂的缺点外，在合成人工抗原时，还会出现异常情况。 6.如前所述，EDC是一类非常活泼的化学交联剂，据文献报道，它可以交联含有多种类 型化学功能基团的化合物，包括羧酸、胺、磷酸、醇类、含巯基化合物等。交联过程至少可分为两步：如图2—l中的反应①和反应②，假定含氨基的半抗原与载体蛋白的交联是通过酰胺键连接，如反应②；然而，EDC也可以通过分子重排与蛋白的羧基结合，成一种稳定的N—取代脲，这一反应过程如图2—l中的反应①和③，在此反应中，载体蛋白如是白蛋白，取代脲就结合到该蛋白的羧基上。 图2—1 碳二亚胺法制备人工抗原交联反应的可能机制 有人认为，在用EDC合成人工抗原时，可能形成两种产物，一种是半抗原—蛋白复合物(即本合成的目的产物——人工抗原)，另一种则是取代脲—蛋白复合物(图2—1)。然而，这两种产物往往是被当作均一的人工抗原作为免疫原给动物免疫的，但是，实际上加到载体蛋白分子上的外源性抗原决定族就有两种，一种是半抗原的，一种是取代脲的，因而，也就可能产 生两种抗体。后一种抗体往往对半抗原的检测专一性和灵敏度有明显的干扰，使问题复杂。用第一种碳二亚胺合成半抗原一蛋白结合物，即用于免疫动物的人工抗原(免疫原)；而用第二种碳二亚胺合成的结合物作为抗体的检测抗原，
半抗原偶联
