清醒大鼠急性高血糖模型的建立及其“肾毒性”损伤特点
及机制研究
岳晓丹 常宝成 贾俊亚 单春艳 朱红 杨菊红 郑妙艳 杨少华 郭振红 徐俊 张欣荣 王靖宇
【摘 要】【摘要】 目的 建立大鼠清醒状态下急性高血糖模型，观察急性高血糖引起肾损伤的特点，并探讨其可能机制。方法 应用随机数字表法将Sprague-Dawley大鼠分为高糖组和对照组(n=10)，颈静脉置管术后行高葡萄糖钳夹实验建立急性高血糖模型。术后第5天高糖组经颈静脉置管泵入50%葡萄糖溶液，使血糖维持于16～18 mmol/L；对照组以同等速度泵入生理盐水，实验持续6 h，留取24 h尿液后处死大鼠并取材。光镜和透射电镜观察肾脏结构损伤，检测肾功能、尿微量白蛋白(UMA)及肾损伤分子-1(KIM-1)等肾损伤指标，检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛及8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHdG)评估氧化应激水平。结果 高糖组出现明显肾脏结构和功能损伤。结构上可见近曲小管细胞肿胀，细胞内线粒体肿胀、排列紊乱；与对照组相比，高糖组24 h UMA、KIM-1及中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)均显著升高(t=-2.969、-2.220、-2.791，P均<0.05)，而血清及肾组织SOD活性明显下降(t=2.537、2.599，P均<0.05)，血清丙二醛、肾组织丙二醛及尿8-OHdG明显升高(t=-2.532、-2.600、-2.968，P均<0.05)。结论 成功建立大鼠急性高血糖模型。急性高血糖可导致肾脏结构和功能损伤，以肾小管损伤为主，氧化应激及线粒体损伤参与急性高血糖“肾毒性”损伤的发生、发展。 【期刊名称】国际内分泌代谢杂志 【年(卷),期】2017(037)004
【总页数】6
【关键词】【关键词】 高糖毒性；肾小管；氧化应激 ·论著·
急性高血糖可抑制胰岛β细胞功能，称为胰岛β细胞的“高糖毒性”[1]。临床中经常会遇到这样的现象：初诊糖尿病患者急性高血糖状态下，会出现尿白蛋白阳性而被诊断为“糖尿病肾病”，特别是伴有酮症的患者。因此，急性高血糖是否也会导致除胰岛以外的其他组织的急性损伤，如“肾毒性”损伤？大量研究提示，严重创伤、手术或重症疾病等情况伴发的急性高血糖常导致急性肾功能衰竭的发生率增加，严格控制血糖可明显改善预后[2]。然而，在这些模型中，往往有麻醉、手术以及药物等因素影响，不能反映急性高血糖本身的作用，损伤机制亦不明确。因此，本研究通过高葡萄糖钳夹技术建立大鼠清醒状态下急性高血糖模型，最大限度排除其他因素的影响，以观察急性高血糖对肾脏结构和功能的损伤及其特征，并对其可能机制作初步的探讨，为临床急性高血糖肾脏损伤的早期发现和及时干预提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 雄性Sprague-Dawley大鼠20只[动物批号：1140070010553；许可证号：SCXK(京)2012-0001]，清洁级，微生物检测合格，体重(260±10)g，购于北京华阜康科技股份有限公司。大鼠分笼喂养，5只/笼，自由摄食和饮水，每日更换垫料，饲养环境清洁，自然光照，温度20～25℃，湿度50%～70%，通风良好。大鼠以经60钴照射的普通饲料喂养，适应性喂养1周后应用随机数字表法分为对照组和高糖组，每组10只。 1.2 实验方法
1.2.1 颈静脉置管术 大鼠禁食不禁水12 h，称量体重，按0.3 ml/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，之后取仰卧位固定于手术台上，行颈静脉置管术，置管预先充满50 U/ml的肝素生理盐水溶液，经皮下从后背穿出，与肝素帽相连，术后关闭皮肤切口，待大鼠清醒后，密切观察其精神状态、进食等一般状态，5 d后行高葡萄糖钳夹实验。
1.2.2 高葡萄糖钳夹实验 大鼠禁食不禁水12 h，固定于固定器中，尾尖采血测定空腹血糖。将Alaris?GH微量注射泵(ALARIS医疗器械公司)与颈静脉置管连接。高糖组以50%的葡萄糖溶液以0.25 g·kg-1·min-1的速度泵入，持续3～5 min，使血糖水平迅速上升，之后以0.6～1.2 ml/h的速度持续泵入，每5 min尾尖采血测定血糖，根据血糖水平调整泵入速度，使血糖维持于16～18 mmol/L；对照组以同等速度持续泵入生理盐水，每5 min尾尖采血测定血糖。实验持续6 h。
1.2.3 标本留取 高糖钳夹实验后，将大鼠置于代谢笼留取24 h尿液，-80℃冰箱冻存。股动脉放血法处死大鼠，留取动脉血，3 500 r/min(r=80 mm)离心5 min，分离血清，-80℃冰箱冻存。大鼠处死后，迅速剖开腹腔，分离并切取肾脏，左肾切取一半固定于电镜固定液送电镜室观察，另一半固定于4%多聚甲醛溶液；右肾分装后立即放入液氮中冷冻，之后转移至-80℃冰箱保存。 1.2.4 指标检测
1.2.4.1 形态学检测 将固定于4%多聚甲醛溶液中的组织取出，蜡块包埋，连续切片(厚度4 μm)，苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察肾脏形态结构变化。取出电镜固定液中的标本，包埋，用LEICA ULTRACUT-R超薄切片机做超薄切片(厚度50 nm±)，HITACHI-7500透射电子显微镜观察，Megaview数字化电
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