荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR(FQ-PCR)就是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点就是:1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA,或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得,大大提高了检测的灵敏度、特异性与精确性。3、动态实时连续荧光检测,免除了标本与产物的污染,且无复杂的产物后续处理过程,高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法:

1、

双链DNA内插染料

某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合,同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合,产生的荧光信号与双链DNA成正比。

SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I就是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程就是:1、开始反应,当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合

SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合,对DNA模板没有选择性,所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性与PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下,本法就是

一种成本低廉的选择。

2、TaqMan探针技术原理

TaqMan探针法就是高度特异的定量PCR技术,其核心就是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板就是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物与一条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也与目的片段一样,有一个同步指数增长的过程。信号的

强度就代表了模板DNA的拷贝数。

5,

TaqMan探针的荧光信号产生机制

根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:普通的TaqMan探针与TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher),本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团,可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下,短的探针比长的更容易设计。实验证明,TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。

TaqMan MGB探针

探针设计一般应符合以下条件:1、探针长度应在20~40个碱基左右,以保证结合的特异性。2、G、C碱基含量在40％-60％,避免单核苷酸序列的重复。3、避免与引物发生杂交或重叠。4、探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。

3、 分子信标技术

分子信标技术(molecular beacon)也就是在同一探针的两末端分别标记荧光分子与淬灭分子,与TaqMan探针不同的就是该探针5′与3′末端自身可形成一个8个碱基左右的发卡结构,此时荧光分子与淬灭分子邻近,因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时,该探针与模板杂交,从而破坏了探针的发卡结构即FRET消失,于就是溶液便产生荧光,荧光的强度与溶液中模板的量成正比,因此可用于PCR定量分析。

Ct 值的含义就是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明 ,每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 ,起始拷贝数越多 ,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 ,因

此

只要获得未知样品的 Ct 值 ,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

1、双链DNA内插染料

常用的就是SYBR Green I荧光染料,其技术原理:SYBR Green I就是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程就是:1、开始反应,当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加

大。

荧光染料检测法一般主要就是利用荧光染料(如SYBR Green I)与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加,优点就是:无需另外设计荧光探针,无需特别优化条件,简便易行,成本较低,能适用于任何一款定量PCR仪。荧光染料法实质上就是常规的PCR反应中添加了荧光染料,借助染料与双链DNA的结合所发出的荧光实时监控反应的进程。由于不需要设计序列特异性探针与优化反应条件,价格低廉,通用性强,而且荧光染料法可用于任何一种型号的定量PCR仪,因而同样得到广泛采用。在PCR反应体系中,加入过量SYBR Green I荧光染料,SYBR荧光染料