２０１８年第５３卷第９期生物学通报５７第２６届国际生物学奥林匹克竞赛试题实验２·分子生物学王戎疆１张立２北京佟向军ｔ范六民１刘宝玉，北京１００８７５（１北京大学生命科学学院１００８７１２北京师范大学生命科学学院天津３０００５１）３天津市第一中学中国图书分类号：Ｇ６３４．９１５文献标识码：Ｅ总分：１００分考试时间：９０ｍｉｎ共１５题本考题由３部分组成。第１部分：质粒的限制酶图（４８分）；第２部分：基于ＰＣＲ的酵母突变体基因分型（３７分）；第３部分：突变酵母的氨基酸营养缺陷（１５分）。任务１：１）检查材料和设备。２）选择限制酶。３）孵育酶切反应。４）配制琼脂糖凝胶。５）准备样品并加载凝胶。６）凝胶电泳唪。任务２：７）拍摄凝胶照片及回答问题。８）设置ＰＣＲ反应。９）ＰＣＲ反应。１０）准备样品并加载凝胶。１１）凝胶电泳：Ｉｃ。任务３：１２）拍摄凝胶照片及回答问题。１３）观察和推论。，Ｉｃ注意：在操作时使用同一块凝胶上不同的样品孔。材料和设备为了完成实验工作，你需要下面列出的材料。请确保可以获取这些材料。每位考生只有一份实验材料，在考试过程中请谨慎操作。请注意：１）为了完成分析，实验中提供的所有液体试剂都超过了所需用量的２倍。在实验过程中出现溢出或错误时，不提供附加材料（包括实验器材和琼脂糖凝胶）。２）为了在管底收集液体，请使用手册中注明的技术。３）考试的目的之一是测试你的实验工作技能。４）标签上标有蓝线的试管应一直保存在冰上。５）所有溶液都处于冷冻状态，所以你必须在使用前对其进行解冻和混匀。材料在本试卷中需要数量材料编号使用的部分Ａ１微量移液管１—１０¨Ｌ１，２Ｂ１微量移液管２０－２００肌Ｌ１，２Ｃ１盒移液枪白枪头１—１０斗Ｌ１，２Ｄ１盒移液枪黄枪头２０—２００“Ｌ１，２Ｅ１ＰＥＲ管架１，２Ｆ１１．５ｍＬ管架１，２Ｇ５１．５ｍＬ管（有管盖）２０．２ｍＬＰＣＲ管（有管盖，Ｈ２不要将管和盖分开）１，２１２孔琼脂糖凝胶Ｉ１（请勿打开包装，直到你准备加载凝胶）１，２ＪｌＯｎｅＲｕｎ电泳系统；缓冲液１，２Ｋ１记号笔１，２Ｌ１秒表／定时器１，２Ｍ１纸巾１，２Ｎ１一套塑料手套（在候考时发放）１，２０２拉锁袋（信封）１，２含有８种不同培养基上生长Ｐｌ３的酵母照片的手册用于生成各种氨基酸的生化反应图Ｑｌ３（在工作区的墙上）Ｒｌ１ＫｂＰ１ｕｓＤＮＡｍａｒｋｅｒ１，２Ｓｌ联系考务人员时所需的粉红卡片１，２，３Ｔ２小型标签１，２Ｕｌ大标签ｌＶ１５４０斗Ｌ水１，２５８生物学通报２０１８年第５３卷第９期材料Ｈ：具有国家代码和学生编号的ＩＤ标签和试管冰桶含有１．５ｍＬ管和一套液体。液体编号１１ｄＮＴＰ数量标签体积（ｐ．Ｌ）６０成分ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰ和ｄ１卯混合物ＤＮＡ聚合酶缓冲液（５×）加载缓冲液，用于琼脂糖凝胶电泳引物对Ａ引物对Ｂ引物对Ｃ引物对Ｄ引物对Ｅ脱氧核糖核酸聚合酶ＤＮＡ２１ＤＮＡｐｏｌ缓冲液上样缓冲液引物Ａ引物Ｂ１４０３１１００４１３０一一ｉ一一１。：ｓｌｍｌ（卵ｐＸ、ｐＺ、ｐＸ：ａｌｂ和ｐＺ：ａｌｂ的限制性酶切图问题１．ＤＮＡ片段大小。（２分）５６７８９１０１ｌ１１１１３０３０３０３０１４１２用标签表示４种质粒完全酶切获得的ＤＮＡ片段的预期大小。引物Ｃ引物Ｄ引物ＥＤＮＡｐｏｌ１Ｋｂｍａｒｋｅｒｍａｒｋｅｒ，用于琼脂糖凝胶电泳缓冲液ｌ（１０ｘ）缓冲液２（１０ｘ）缓冲液３（１０ｘ）野生型模板ＤＮＡ突变体模板ＤＮＡ质粒１质粒２ＡｐａＩ限制酶ＥｃｏＲＩ限制酶ｌｌ１缓冲液Ｉ缓冲液２８１２１３１４１５１１１８８６缓冲液３模板ＷＴ突变体模板质粒１质粒２ＡｐａＩＥｃｏＲＩｌ１１１６６６６６１６１７１８１９ｌ２０１ＳｍａＩ６ＳｍａＩ限制酶酶限制酶及其最佳反应条件表缓冲液１中的活性百分比２５１０１００Ｏ１限制酶选择（４８分）缓冲液２中的活性百分比５０１００７５Ｏ缓冲液３中的活性百分比１００１０１０ｌｏｏ最佳反应温度（℃）２５３７３７２５设计一个实验以确定酿酒酵母中蛋白质Ａｌｂ的亚细胞定位。实验策略要求将基因ａ／ｂ（９９９ｂｐ）与编码２种不同荧光蛋白的序列融合。这是通过将基因克隆到２个质粒骨架（ｐＸ和ｐＺ）中实现的，最终可得到质粒ｐＸ：ａｌｂ和ｐＺ：ａｌｂ。用２个连接混合物转化大肠杆菌。纯化来自２个大肠杆菌转化体的质粒，得到“质粒管１”和“质粒管２”中的ＤＮＡ。请确定２个管中包含有４个可能质粒（ｐＸ，ｐＸ：ａｌｂ，ｐＺ或ｐＺ：ａｌｂ）中的哪２个（每个管中１个）。ＡｐａｌＥｃｏＲＩＰａｃＩＳｍａｌ对２个质粒进行严格的限制性内切酶设计。问题２．选择限制性内切酶。（４分）你有３种限制酶可用：ＡｐａＩ、ＥｃｏＲＩ和ＳｍａＩ。点击这３种酶中的一种，可以区分４种可能的质粒。请注意，长度小于１００ｂｐ的ＤＮＡ片段将产生非常微弱的条带，并且不能准确地确定它们的大小。Ａ．ＡｐａＩＢ．ＥｃｏＲＩＣ．ＳｍａＩ２０１８年第５３卷第９期生物学通报５９问题３．设计研究方案。（４分）步骤：１）分别用Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３和Ｓ４标记Ｏ．２ｍＬ泳分析限制酶酶切的效果。ＰＣＲ管。琼脂糖凝胶：——２）设计酶切实验，以确保使用所有２种质粒，其中包含未切割质粒ＤＮＡ的对照。每个反应的总体积应为１０“Ｌ。典型的限制酶酶切包括：２“Ｌ质粒ＤＮＡ，ｌ斗Ｌ限制酶，１斗Ｌ缓冲液和加水至终体积为１０斗Ｌ。用整数表示添加到４个管中的每一种液体体积（所有量都以斗Ｌ计）。如果不添加此特定成分，请写入“０”。ＳＩ（ＩｘＬ）质粒管１Ｓ２（ｐ，Ｌ）（对照）Ｓ３（ＩＬＬ）警告：电气危险－ＲｕｎＯｎｅ电泳仪一旦启动就不要移动。开始时，请勿将物品穿过设备盖子的薄片加入。ｓ４（ｔｘＬ）（对照）质粒管２ＡｐａｌＥｃｏＲＩＳｍａｌ１０１０１０警告：潜在的危险化学物质。当处理琼脂糖凝胶时，始终佩戴手套，因为它是与ＤＮＡ结合染料一起预染的。建议的操作流程：通过琼脂糖凝胶电泳分析第１部分和／或第２部分的样品。ａ．加载第１部分的样品并运行１５～２０ｍｉｎ。ｂ．停止设备。ｃ．力Ⅱ载第２部分Ｘ缓冲液１ｘ缓冲液２Ｘ缓冲液３水样品。ｄ．重新启动设备，再运行１５－２０ｍｉｎ。电泳方案：１）戴橡胶手套。２）将ＲｕｎＯｎｅ电泳室的盖子抬起直立。３）从白色袋子包取出琼脂糖凝胶准备进行电泳。拆下透明盖子，并将凝胶从透明外壳小心地提起。小心处理凝胶，因为它容易断裂。保留白色袋子供以后使用。４）检查凝胶是否存在明显的损坏，如裂缝／缺少孑Ｌ或凝胶内部有气泡总容积问题４．酶切的反应条件。（２分）继续步骤：３）按照问题２中的说明，混合限制性酶切反应的必要组分。４）将移液器的体积设置为５¨Ｌ，并通过在每个管中上下吸打５～１０次进行充分混合。始终保持移液管尖端在液体表面以下，避免产生气泡。５）将０．２ｍＬ管放在小的拉链锁袋中。关闭袋子，并将标签上的ＩＤ号贴在包装袋外面。请指出你用于酶切的反应条件：Ａ．２５℃Ｂ．３７℃等。如果你发现此类问题，请立即通过举起粉红色卡片向考务人员报告。５）如下图所示放置凝胶。ＲＬ…‘１¨ｃ‘ｌ－，Ｉ、＿＿·囡：●ｌ▲▲▲－Ｉ·ｏｏＲｕｎＯＦｉｅ电泳室（左）和琢脂椐凝胶的取问继续步骤：６）举起你的粉红色卡片与考务人员联系，考务人员会将你的样品送到所选的培养箱。完全酶切质粒ＤＮＡ需要１５ｒａｉｎ的孵育。７）２０ｍｉｎ后，你的粉红色卡片会提示你收回继续操作步骤：样品。８）请检查你是否收到了自己的样品。９）向每个样品中加入３“Ｌ加样缓冲液。１０）通过上下吸打１０次混合（避免产生气泡）。使用标准琼脂糖凝胶电泳方法，通过凝胶电７）凝胶应完全浸没在缓冲液中。如果不能，请考务人员提供适当的帮助。８）如下２个表（第ｌ部分的样品、第２部分的样品）所述装载琼脂糖凝胶。加载３斗Ｌ１Ｋｂｍａｒｋｅｒ、１３灿样品（第ｌ部分）和１５斗Ｌ（第２部分）。生物学通报２０１８年第５３卷第９期第１部分（１—５孔）孔ｌ２３４５样品ｌｌ（ｂｍａｒｋｅｒＳｌＳ２（对照）Ｓ３ｓ４（对照）体积（斗Ｌ）３１３１３１３１３第２部分（６～１２孔）孔６７８９ｌＯｌｌ１２样品ｌＫｂｍＥｋｅｉＰＣＲ—ｌＰＣＲ一２ＰＣＲ一３ＰＣＲ＿４ＰＣＲ一５ＰＣＲ一６体积（“Ｌ）３１５１５１５１５１５１５继续电泳步骤：９）将盖子放在ＲｕｎＯｎｅ装置上（有标签的一面向下滑人电源盒）。１０）检查电压是否设置为１００Ｖ，否则使用“电压选择”按钮。１１）按“运行／停止”按钮打开电源，运行凝胶电泳１５－２０ｍｉｎ。请注意，你将无法看到通过凝胶实时迁移的ＤＮＡ带，但缓冲液中的蓝色指示剂与３００ｂｐＤＮＡ片段的迁移速度相同。１２）２０ｍｉｎ后，按“运行／停止”按钮关闭电源。１３）举起你的卡片，考务人员将带给你在琼脂糖凝胶上查看ＤＮＡ所需的设备，并记录下来。１４）通过使用你的平板电脑和考务人员为你带来的设备，将凝胶中的ＤＮＡ带记录下来。考务人员将协助你进行记录。１５）将托盘中的琼脂糖凝胶转移到灯台上。１６）将黑色照片罩放在灯台的顶部。１７）将平板电脑放在照相机的顶部，使透镜向下指向室内。１８）拍摄你的凝胶图片。问题５．拍照记录你的ＤＮＡ电泳结果。拍摄ＤＮＡ凝胶的３张照片。这些图像将用于判断你的ＰＣＲ和限制酶酶切反应是否成功。上传你的３张凝胶图像。完成拍照，请将凝胶转移到交付的白色袋子里。问题６．使用限制酶酶切质粒ＤＮＡ。在下图中指出质粒ＤＮＡ是否已被添加的限制酶酶切。Ｌ，酶切术酶切Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４现在请根据提供的标准凝胶图片，对照你选择的限制酶获得的结果（问题３）。使用这张照片回答问题７和８。请注意，你只有在完成凝胶记录后才可以使用标准图片。ｋｂＰｌＩｌ、Ｉ）Ｎ＼ＩａｄｄｅＣ（Ｗａｉｎｓ：１００ｂｐ，２００ｂｐ．３∞ｂｐ．４００ｂｐ．５００ｂｐ，６５０ｂｐ。８．５０ｂｐ，１０（｝０ｂｐ，１８５０ｂｐ，２ｋｂｐ，３Ｉ【ｂｐ，４Ｉ由ｐ．５Ｉ由ｐ６魄７Ｉｃｂｐ．８Ｉ由ｐ９吼１０Ｉｃｂｐ。１１ｋｂｐ。１２Ｉ由ｐ使用提供的ＤＮＡｍａｒＩ‘ｅｒ作为参考问题７．限制酶酶切的ＤＮＡ片段大小。如果在限制酶酶切中存在给定大小的ＤＮＡ片段，则用标签表示出来。Ｉ圈圈堡童Ｊｌ兰：坐查ｂ问题８．每管中质粒的鉴定。指示出每个管中存在哪些质粒，不存在哪些质粒。如果不能确定管中的质粒存在与否，则在最后一列中用“＋”表示。ｏ。｛ｆｅ．１【仃存质柏ｊｉ不存尢质轴ｊＩＭＩＥＸ站ＩＩＫ．ＩＥＴＯＰｔ．Ａ畎ＳＭ∞Ｐ…ｔ．ＡＳ…Ｄ—ＰＺ。Ｐ～ｔＡ，．．ＣＨＩＤ蠛辩ｅＰｘＰ×灿Ｐｚ舢掣二！…‘
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