RNA会干扰电泳结果的。
质粒检测
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。
三、实验步骤
1．大肠杆菌感受态细胞的制备（可临用前准备，也可制备多管加甘油冻存-80℃）
（1）从新鲜的DH5α菌株平板上挑取一个单菌落，（接种到4ml LB液体培养基中）37℃，180rpm培养过夜。
（2）次日按照1：100的比例转接培养物于20mlLB液体培养基当中，37℃，180rpm培养至OD值达到0.4-0.6。
（3）取培养物1ml到1.5ml 离心管中，冰浴10min，5000rpm离心5min收集菌体。
（4）弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 1ml 后旋起菌体（在涡旋器上振荡），冰浴30min。
（5）5，000rpm离心10min后弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 100ul。 （6）温和混匀后4℃放置24-48h备用。 2．质粒的转化
（1）取制备好的感受态菌体，加入质粒5ul（可变）。
（2）冰浴30min后，42℃水浴热激90s（温度准确，速度要快把握好时间）。 （3）取出后再冰浴5min；加入800ul LB液体培养基。 （4）37℃，150rpm复苏1h。
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（5）取10ul培养物涂布于含有抗生素的LB（由质粒的抗性决定），37℃倒置培养。（对照组不加抗生素）
3．质粒提取（或用试剂盒提取）
（1）从4℃拿出长满菌体的LB平板，打开培养皿，用在酒精灯上烧过的镊子夹取100ul的吸头挑取单菌落，之后把带有菌落的吸头放入带有抗生素的LB液体培养基（4ml或10ml，认真标记）37℃振荡培养过夜。（若是第二天进行二次活化，则按照1：20的比例接种培养基，37℃振荡培养3小时，记得加抗生素）。
（2）取1ml菌液加入1.5ml的离心管中，认真标记后把剩余的菌液冻存（0.5ml的菌液，0.5ml纯的甘油，认真标记）12，000rpm离心5min收集菌体。
（3）5000rpm离心5min收集菌体，弃上请后再离心5s,吸取残余的上清。 （4）向每个离心管中各加入100ul预冷的溶液Ⅰ,在混悬器上振荡使菌体充分悬浮，分散。（在冰上）
（5）再向每个离心管中各加入200ul新配制的溶液Ⅱ，缓慢倒转几次混匀。（在冰上）
（6）向每个离心管中各加入150ul溶液Ⅲ，缓慢倒转几次混匀。（在冰上） （7）12，000rpm离心10min，转移上清至一新离心管中。
（8）向每个离心管中各加入酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀后12，000rpm离心10min。
（9）吸取上清（注意不要吸到中间层）到1.5ml离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置20-30min（或室温放置10min）12，000rpm离心10min，弃上清，（小心不要把质粒倒掉）
（10）加1ml 70％乙醇洗涤沉淀（来回颠倒旋转几次），12，000rpm离心3min，弃上清，室温干燥20min，将沉淀溶于20ul的TE或水中，-20℃备用。
注：一般在第二步离心收集完菌体后再加入1mlSTE，充分洗涤菌体，12，000rpm，离心1～2min。
4．质粒检测琼脂糖凝胶电泳
核酸DNA在PH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。琼脂糖具有多孔的网状结构，不同大小的核酸分子利用凝胶的分子筛效应得以分开。实践中观察琼脂糖凝胶中DNA是利用荧光染料溴化已锭（EB）将DNA染
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色。溴化已锭与DNA结合，在254nm波长的紫外灯下呈现橙黄色的荧光条带。
（1）以配制浓度为1%胶为例：取一个50ml锥形瓶（制胶专用），加入0.5g琼脂糖后加1×TAE至50ml放入微波炉内加热（火力中高，时间3min），待液体沸腾后拿出锥形瓶（注意不要烫住手），用吸取50ul的EB（1：1000）加入锥形瓶内。等到锥形瓶不烫手后向制胶板内倒胶，高度不要漫过制胶板沿，冷却，待胶凝固后拔出梳子。
（2）配制电泳液：取一个500ml的广口瓶，加入10ml 50×TAE，加双蒸水至500ml。
（3）待胶板放进电泳槽后向电泳槽内加入配好的电泳液，高度漫过胶板1mm。
（4）点样：拿出裁成长条的称量纸光面向上（或一次性手套），用10ul移液器吸取3ul的质粒，打在称量纸上，再用10ul移液器吸取2ul的上样缓冲液和质粒混匀，吸取混合液5ul打入点样孔。
（5）电泳：接通电源，电压设定在80v（可变），开始电泳。
（6）凝胶系统成相：等到指示剂快跑到胶板前沿时关闭电源，拿出胶板，放在暗箱内，打开与暗箱相连的电脑，进入摄像软件，进行摄像，然后保存照片。
注：DNA分子的大小 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
不同 浓度 琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围 琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
四、溶液配方（详细参考分子克隆实验指南）
LB液体培养基：每配制1000ml加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g。 LB固体培养基：每配制1000ml加入胰蛋白胨10 g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂糖1.5g。
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溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl (pH8.0)，10 mM EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅱ：0.2 M NaOH(临用前用10 M贮存液稀释)，10%SDS(现用现配)。 溶液Ⅲ：60ml 5 M乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5ml水。
TAE(50×)：242g Tris碱，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)，用时稀释50倍。
加样缓冲液(6×)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。 溴化乙锭（或其无毒替代品）：10mg/ml。
RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
五、常见问题
1. 加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？
细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？
（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
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（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？
（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。解决方法：补加RNase A1。 （2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？
（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。解决方法：使用新鲜培养的细菌。 （2）宿主菌富含核酸内切酶。解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。或者将质粒DNA进行乙醇沉淀。
（3）质粒DNA在Solution II中暴露过久，易造成质粒DNA的切口断裂。裂解步骤控制在5分钟内完成。
（4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。 5.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现基因组DNA的污染？
（1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组DNA断裂所致。解决方法：温和地进行菌体的裂解和中和。
（2）加Solution II时操作时间过长，造成基因组DNA断裂所致。解决方法：将裂解步骤控制在5分钟内完成。
（3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组DNA，使用生长良好的新鲜细菌。 6.加样时DNA飘出加样孔外？
忽略或省略了高速离心以甩干残留的Rinse B的操作步骤。解决方法：按说明书的操作步骤操作以确保残留的Rinse B被甩干。 7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？
是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。 8.质粒为何会丢失？
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细菌培养不要超过16小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
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碱裂解法提取质粒-配方，最好的说明
