转氨酶、硝态氮、铵态氮等测定方法

转氨酶、硝态氮、铵态氮等测定方法

转氨酶（谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)的测定：（2.5g样）（参考吴良欢等的《植物转氨酶（GOT和GPT）活度比色测定方法及其应用》）

O.05mol/L Trs—HCL缓冲液(pH7．2)：0.2mol／L 三羟甲基氨基甲烷(30.25g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200m1)200ml和0.2mol/L HC1 221ml，用蒸馏水稀释至1000ml。

0．1mol／L磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)11.928g，磷酸二氢钾(AR)2.176g，加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。

2，4一二硝基苯肼溶液：称取2，4一二硝基苯肼0.099g，用10mo/L HCl 50ml溶解后，加蒸馏水至500rnl，保存于棕色瓶中备用，此液可保存3个月。

0.4mol／L氢氧化钠溶液：32g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至2L。

lmol／L氢氧化钠溶液：10g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至250ml。

丙酮酸标准液(2 μmol／m1)：精确称取纯丙酮酸钠0.022g 于100ml容量瓶中，加0.1mol／L磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。

GOT底物液(DL一门冬氨酸200mmol／L，a一酮戊二酸2mmol／L)：称取a一酮戊二酸0.073g和DL一门冬氨酸6.65g置于一小烧杯中，加入lmol／L氢氧化钠51.25ml使溶解，并校正pH至7.4，然后将溶液移入250ml容量瓶内，用0.1mol／L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。

GPT底物液：(DL一丙氨酸200mmol／L，a一酮戊二酸2mmol／L)：称取a一酮戊二酸0.073g和DL--丙氨酸4.475g置于一小烧杯中，加入0.1mol／L磷酸盐缓冲液(pH7.4)约200ml煮沸溶解后，待冷，用lmol／L氢氧化钠调pH至7．4(约

加1.25m1)，再加0.1mol／L磷酸盐缓冲液至25Oml混匀，加氯仿数滴防腐，贮于冰箱内。

粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称2.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0．05mol／LTris—HC1缓冲液（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

1 谷草转氨酶(GOT)的测定：

0.1ml粗酶液 ＋ GOT底物液0．5ml(对照仅加粗酶液0.1ml)，置37℃水浴，60min后取出，各管加0.5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0.5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，蒸馏水调零点，读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度，得吸光度差值，查工作曲线即可查得丙酮酸体积(m1)。若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(m1)。

工作曲线绘制：取lOml试管5支，各管加0.1mol／L磷酸盐缓冲液0.1ml，分别加GOT底物液0.5、0.45、0.4O、0.35、0.30ml，丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20ml。置37℃ 水浴5min，各管加0．5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0．5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度，以各管丙酮酸体积为横座标，以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

2 谷丙转氨酶(GPT)的测定：

0.1ml粗酶液 ＋ GPT底物液0．5ml(对照仅加粗酶液0.1ml)，置37℃水浴，30min后取出，各管加0.5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0.5ml GPT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，蒸馏水调零点，读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度，得吸光度差值，查工作曲线即可查得丙酮酸体积(m1)。若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(m1)。

工作曲线绘制：取lOml试管6支，各管加0.1mol／L磷酸盐缓冲液0.1ml，分别加GPT底物液0.5、0.45、0.4O、0.35、0.30、0.25 ml，丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 ml。置37℃ 水浴5min，各管加0．5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0．5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度，以各管丙酮酸体积为横座标，以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

结果计算

转氨酶活度以每克植物鲜样在30min内反应生成的丙酮酸微摩尔(μmol)表示。

GOT活度，μmol／g·30min=(C×V×20)／(m×2)

GPT活度，μmol／g·30min=(C×V×20)／(m×2)

式中，C一丙酮酸标准溶液的浓度(μmol／m1)；V一由工作曲线查得的丙酮酸体积(m1)；2O一稀释倍数；2一反应时间换算系数，GOT实际反应时间为1h，按习惯本法酶活性以30min计算，故应除以2；m一植物鲜重(g)。

3 谷酰胺合成酶（GS）的测定：