基因组测序原理
自1977年，桑格测定了第一个基因组序列（噬菌体X174的，全长5375个碱基）开始，基因测序技术已经发展到了第三代，转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括 mRNA和非编码RNA 。支撑基因组测序的共有一下几大技术：Sanger双脱氧末端终止法、PCR技术，这里主要介绍一下第一种技术。
Sanger双脱氧末端终止法：其基本原理即双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的 ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的 DNA 片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取 DNA 双链的碱基序列，如下图。
另外，大规模基因组测序有两种方法：逐步克隆法与全基因组霰弹法。
定位克隆原理
定位克隆（positoinal cloning），又称图位克隆（map-basedclonig），1986年首先由剑桥大学的AlanCoulson提出。用该方法分离基因是根据功 能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁 图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并单明其功能和疾病的生化机制。
人类基因组计划已确定了一系列分布于全基因组24条染色体上的分子标记。根据这些分子标记的序列和定位信息，结合杂交或PCR的方法可以快速检测染色体上与肿瘤或遗传性疾病相关的热点位置，进而从中克隆疾病相关基因。定位候选克隆克服了经典的定位克隆纯粹依靠连锁分析进行染色体定位的繁冗而缓慢的弊端，大大加快了克隆工作的进程，而且它也不仅仅局限于遗传病，现在已更多地运用于肿瘤易感基因的克隆工作。
定位克隆技术主要包括以下6个步骤：
1.筛选与目标基因连锁的分子标记。利用目标基因的近等基因系或分离群体分组分析法（BSA） 进行连锁分析，筛选出目标基因所在局部区域的分子标记。
2.构建并筛选含有大插入片段的基因组文库。常用的载体有柯斯质粒（cosmid）， 酵母人工染色体（YAC）以及P1，BAC，PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库，得到阳性克隆。 3.构建目的基因区域跨叠克隆群（contig）。以阳性克隆的末端作为探针基因组文库，并进行染色体步行，直到获得具有目标基因两侧分子标记的大片段 跨叠群。
4.目的基因区域的精细作图。通过整合已有的遗传图谱和寻找新的分子标记，提高目的基因区域遗传图谱和物理图谱的密谱的密度。
5.目的基因的精细定位和染色体登陆。利用侧翼分子标记分析和混合样品作图精确定位目的基因。接着以目标基因两侧的分子标记为探针通过染色体登陆获得含 目标基因的阳性克隆。
6.外显子的分离、鉴定。阳性克隆中可能含有多个候选基因。用筛选cDNA文库，外是子捕捉和cDNA直选法等技术找到这些候选基因，再进行共分离，时空表达特点，同源性比较等分析确定目标基因。
qRT-PCR
原理
qRT-PCR即实时荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。qRT-PCR在RT-PCR体系中同时加入内参标基因的引物，使目的基因和内参基因在同一条件下同时扩增。在扩增反映结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行半定量分析，但分析的是PCR终产物，不能准确分析未经PCR信号放大之前的起始模板量。
普通PCR技术主要是在PCR结束后对终点产物进行定量分析而qRT-PCR技术是实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
qRT-PCR涉及到一个关键词Ct值，是指扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。如下图所示。
定量PCR的数学原理 ?理想的PCR反应：
X=X0*2n
?非理想的PCR反应：
X=X0(1+Ex)n
n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
在扩增产物达到阈值线时:
XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)
XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0(1+Ex)Ct(2) 整理方程式(2)得:
log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3) 最后结论：
Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量
Log起始拷贝量与Ct呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
基因组测序原理
