湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划
项 目 申 报 表
项目名称:侗药人头藤对大鼠脑缺血再灌注后的神经保护作用的实验研究 学校名称 学生姓名 蒋林奇 杨贤英 于梦婷 陈勋 指导教师 湖南医药学院 学 号 20143010927 20143010915 20143011001 20143011022 专 业 临床 临床 临床 临床 性 别 男 女 女 男 入 学 年 份 2014 2014 2014 2014 临床医学 蔡世昌 讲师 项目所属 职称 郑钦方 药师 一级学科 学生曾经参与科研的情况 在大一期间我们曾调查过同学的头发（卷发直发）。 指导教师承担科研课题情况 导师蔡世昌长期从事大鼠脑缺血及神经再生的研究，导师曾参与国自基金课题《脑缺血预处理对神经细胞保护作用及机制研究》，参与山东省科技厅科技攻关课题《脑缺血再灌注后神经细胞再生及凋亡逆转机制的研究》，其后又主持了省教育厅科研课题《SD大鼠脑缺血再灌注后再生神经元的形态观察及分泌GABA和ACH的实验研究》。参与参与省教育厅科研一项，参与省卫生厅科研项目一项；参与省教育厅教改课题一项；参与校级科研课题两项。主编省级教材1部，副主编省级教材2部，参编国家级教材一部，参编教参两部。先后以第一作者在各类杂志发表论文十余篇，其中被SCI收录1篇（通讯作者），CSCD收录2篇。 导师郑钦方主要从事中药、侗医药科研工作。获2014年中国民族医药科学技术奖发明奖3等奖（排名第二）1项，怀化市科技进步奖二等奖1项，参与七叶一枝花种苗快繁关键技术研究，血藤果植物雌激素提取分离与开发，血藤口服液的研发。
项目研究和实验的目的、内容和要解决的主要问题 目的 研究人头藤对大鼠脑缺血再灌注后的神经保护作用。 内容 1.药材提取 取人头藤，分别加10倍、8倍水煎煮2次，第1次2h、第2次1h，合并煎液，滤过，减压浓缩，加适量活性炭，滤过，冷冻干燥。使用时加适量注射用水，滤过，调节 PH 至 6.5～7.2，灌封，灭菌，即得。 2.分组 将清洁级SD大鼠分随机分为空白对照组，丹参组，假手术组，人头藤高中低组（80、40、20mg/kg）,每组12只。 3.建模 建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型（MCAO）。用处理过的尼龙线沿剪口从颈外动脉残端插入，经右侧颈总动脉（CCA）进入颈内动脉（ICA），以CCA分叉处计算进线深度为18.0±0.5mm，至大脑中动脉起始部，造成局灶性脑缺血状态。缺血2 h后进行再灌注, 再灌注时间30min、1h、2h、4h、6h、12h、24h、3d、7d。 4.模型的评定 ①运动障碍评分 实验后24h，采用5分制行为学评分标准给动物行为评分：行为正常为0分；右前爪不能完全伸展为1分；自发转圈或向右侧行进为2分；仅在受到刺激时行进为3分；对刺激无反应为4分。以评分在1-3之间的大鼠为实验对象。 ②脑梗死面积的测量 评分后断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，冠状位切成5片。第1刀在脑前极与视交叉连线中点处，第2刀在视交叉部位，第3刀在漏斗柄部位，第4刀在漏斗柄与后叶尾极之间。脑片置于2％TTC中染色，采用Image Pro plus 6.0图像分析软件处理并做统计，计算每张脑片的梗死面积和总面积，脑梗死面积比（％）＝脑片梗死总面积÷脑片总面积×100％。 5.脑含水量及抗氧化指标的测定 ①再灌注2h后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，取右半脑，生理盐水冲洗，用滤纸轻吸脑表面的水分，将其放在已知质量的载玻片上，准确称取总湿质量，然后放入100℃烘箱中烘烤12h，准确称取总干质量，然后计算出脑干质量，按照公式脑组织含水量=［（总湿质量－载玻片质量）－（总干质量－载玻片质量）］÷（总湿质量－载玻片质量）×100％。 ②另取左半脑，按质量与体积比为1:9比例冰浴下4℃生理盐水制备成10％的脑组织匀浆。用超氧化物歧化酶（SOD）测试盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒及丙二醛（MDA）试剂盒来测试实验后大鼠SOD、GSH-PX的活性及MDA的含量。 6.数据统计采用SPSS13.0软件系统处理，统计实验数据以?x±s 表示，p<0.05为差异具有统计学意义。 要解决的问题 1.建立稳定的SD大鼠MCAO模型； 2.评价人头藤对大鼠脑缺血再灌注后的神经保护作用。
国内外研究现状和发展动态 人头藤，又名黑老虎，别名冷饭团、臭饭团、酒饭团、过山龙藤、大钻、万丈红、透地连珠、紫根藤、外红消、红过山、钻骨风、大叶南五味。拉丁名Kadsura coccinea.木兰科，南五味子属。味辛、微苦，性温。具有行气止痛、散瘀通络的功效，主要用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、胃病及妇科病等[1]。现代医学研究表明黑老虎具有抗氧化[2]、抗肿瘤[3]、抗病毒[4]、抗肝纤维化[5]等作用。侗医药取其藤茎入药，习惯称为人头藤，其化学成分主要包括木脂素类、三萜类、单萜类、倍半萜类、甾体类和氨基酸等[6]。其提取物中的花青素和多酚类成分具有抗氧化作用[2]。Yang 等[7]评估了这些木脂素的生物活性，ananolignan F、L 在体外实验中表现出较强的神经保护作用。研究发现人头藤还具有具有抗菌活性和细胞毒性，为未来开发抗菌药和抗肿瘤药物提供新方案[8]。人头藤和鸡血藤是两种完全不同的药物[9]，有文献报道鸡血藤提取物鸡血藤总黄酮对大鼠脑缺血具有神经保护作用，其可能机制为鸡血藤总黄酮具有抗氧化作用，可以抵抗脑缺血后的氧化应激作用，从而减轻细胞损伤[10]。而人头藤与临床脑缺血疾病的关联性目前尚无文献报道。 参考文献 [1]胡熙明,张文康,朱庆生,等.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1999. [2]Sun J,Yao J Y,Huang S X,et al. Anti-oxidant activity of polyphenol and anthocyanin extracts from fruits of Kadsura coccinea (Lem.)A.C.Smith[J].Food Chem,2009, 117(2): 276-281. [3]李贺然.新型羊毛甾烷类化合物、其制备方法及抗癌用途[P].中国专利: CN 101607886A, 2009-12-23. [4]Liu J S,Li L.Kadsulignans L-N,three dibenzocyclooctadiene lignans from Kadsura coccinea [J].Phytochemistry,1995,38(1):241-245. [5]李文胜,陈骏,文家萍,等.冷饭团对实验性肝纤维化的防治作用及其机制[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(6):200-201. [6]舒永志,成亮,杨培明,等.黑老虎的化学成分及药理作用研究进展[J].中草药,2011, 42(4):805-813. [7]YangJH,Zhang H Y,Wen J, et al. Dibenzocyclooctadiene lignans with antineurode- generative potential from Kadsura ananosma [J].J Nat Prod,2011,74:1028-1035. [8]Zeng X B,Wang H, Gong ZQ, et al.Antimicrobial and cytotoxic phenolics and phenolic glycosides from Sargentodoxa cuneata[J]Fitoterapia.2015,101:153-161. [9]张白，韩文正，罗凌燕.鸡血藤与大血藤的区别[J].中国中医药现代远程教育，2006,4：52. [10]徐爱钰，陈从显,许勇,等.鸡血藤总黄酮对大鼠脑缺血的保护作用及机制研究[J].滨州医学院学报，2012,35（5）:339-341. 本项目学生有关的研究积累和已取得的成绩 在此之前，我们查阅了大量国内外关于脑缺血的资料，从大量侗药中筛选出抗氧化性强的人头藤作为研究对象。通过阅读资料和导师指导，对实验所需的动物模型的原理和操作步骤有了深刻的理解。
项目的创新点和特色 1.人头藤对脑缺血后神经保护作用的研究为国内首次。 2.药材为采于怀化本地的侗药,通过水提法提取药物。 项目的技术路线及预期成果 清洁SD大鼠 空白对照组（12只） MCAO模型组（36只） 丹参阳性对照组（36只） 假手术组（12只） 随机分组 1组12只 (注射20mg/kg的人头藤提取液） 2组12只 (注射40mg/kg的人头藤提取液） 3组12只 (注射80mg/kg的人头藤提取液） 随机分组 1组12只 (注射20mg/kg的丹参提取液） 1组12只 (注射40mg/kg的丹参提取液） 1组12只 (注射80mg/kg的丹参提取液） 抗氧化性指标的测定 测量SOD、GSH-PX的活性及MDA的含量。 统计分析，得出结论。 预期成果 1.得到人头藤改善大鼠急性脑缺血后抗氧化应激的数据； 2.撰写1-2篇论文在国家级、省级核心期刊上发表。
年度目标和工作内容（分年度写） 2015年3月-2015年05月 搜集并整理资料； 2015年6月-2016年01月 建立大鼠MCAO模型、制备人头藤的提取物； 2016年2月-2016年12月 进行实验，统计数据，得出结论； 2017年1月-2017年03月 发表论文。 指导教师意见 该项目在查阅大量资料的情况下筛选出怀化地区产侗药人头藤对大鼠进行预处理，观察其急性脑缺血再灌注情况下神经细胞抗氧化能力的变化。项目立意新颖，设计合理，可行性高。具有很好的研究前景和社会经济应用价值。推荐该项目为省大学生创新项目。 签字： 日期： 注：本表栏空不够可另附纸张
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