细胞培养
无菌操作基本技术
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2钢瓶之CO2压力。
5.2. CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。
实验用品
1. 种类：
1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet外，其它均为塑料无菌制品。
1.2. TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料离心管：15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP)为不透明材质，polystyrene (PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml，250ml，500ml，1000ml。
2. 清洗：
2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。
2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。
3. 灭菌：
3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。
3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 ℃, 15 lb, 20 分钟处理。
培养基
1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。
2. 液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。
3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。
3.2. 材料：
纯水（milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要），粉末培养基，NaHCO3，电磁搅拌器，无菌血清瓶，0.1或0.2 mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体
3.3. 步骤：
3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q水中，搅拌使其溶解。
3.3.2. 称取适量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5分钟。
3.3.3. 将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)
3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。
附-配制培养基之生长测试
材料：
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 步骤：
1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。
2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。
3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。
5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。
7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。
抗生素
1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素
1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。
1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze前培养基须添加抗生素，待token freeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。 4. 去除细菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 250ug/ml, bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。
5. 抗生素使用种类与浓度： 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌
penicillin streptomycin chlotetracycline gentamicin amphotericin B nystatin fungizone
100 units/ml -20℃ 100 ug/ml -20℃ 50 ug/ml 50 ug/ml 2.5 ug/ml 50 ug/ml 2.5ug/ml
-20℃ -20℃ -20℃ -20℃ -20℃
G(+) bacteria
G(+) and G(-) bacteria
G(+) and G(-) bacteria
G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma yeast and molds yeast and molds yeast and molds
血清
1. 血清必须贮存于–20～–70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml 分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。
5. 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。
6. 血清之沉淀物
6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm, 5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。
6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
附-血清之生长测试 材料：
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 6-well TC plate (or 35mm TC dish) methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 步骤：
1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80% confluency。
2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102活细胞数/ ml。
3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。
4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。
5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。 6. 去除固定液，水洗二次。
7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。 8. 去除染液，水洗二次。 9. 以肉眼计数群落数
10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)：
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。订购多量同一批号的优良血清，置于–70℃保存之
细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。
2. 材料：
2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10ml 分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。 2.3. 新鲜培养基
2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤：
3.1. 附着型细胞（adherent cell）3.1.1. 吸掉旧培养液。
3.1.2. 用D-PBS洗涤细胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液)。
3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。
细胞冷冻保存
1. 注意事项：
1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好（log phase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4. 冷冻保存之细胞浓度：
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3*106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。
1.5. 冷冻保护剂浓度为5或10％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
1.6. 冷冻方法：
1.6.1. 传统方法: 4℃ 10分钟---> -20℃ 30分钟---> -80℃ 16-18小时(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 长期储存。
1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以–1～–3℃/分钟之速度由室温降至–120℃，放在液氮槽vapor phase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
2. 材料：
2.1. 生长良好之培养细胞 2.2. 新鲜培养基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球计数盘与盖玻片
2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II) 3. 步骤：
3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液((约0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30分钟→ -80℃ 16～18小时(或隔夜)→液氮槽vapor phase长期储存。
3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7:
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