薄层色谱与薄层扫描

第一节 吸附色谱

一、吸附色谱的原理

吸附色谱法溶解于一相中的混合物的单一组分在另一相界面上会呈现出浓度变化，另一相表面常常出现组分的浓缩，这种现象称之为吸附。吸附性薄层色谱法是将吸附剂在光洁的表面，如玻璃、金属或塑料等表面上均匀地铺成薄层，而后在上面点上样品，以流动相展开，这样，组分不断地被吸附剂吸附，又被流动相溶解，解吸而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力，与吸附剂结合较紧密的组分较难被展开剂解吸，而与吸附剂结合较松散的组分则较容易被展开剂解吸。因此在流动相向前流动的过程中，不同组分移动距离不同，原有的混合物就可以得到分离。分离度一般用比移值Rf值来表示，其数值可以通过被分离组分斑点中心离原点的距离与展开剂前沿离原点的距离之比计算出来。 二、吸附色谱中对固定相的要求

吸附色谱的固定相常称为吸附剂。目前最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝，其次是聚酰胺、硅酸镁等，还有一些物质如氧化钙(镁)、氢氧化钙(镁)、硫酸钙(镁)、磷酸钙(镁)、淀粉、蔗糖等，但因碱性太大或吸附性太弱，致使用途有限；而活性炭的吸附性太强，本身又是黑色，故很少用于色谱分离。具体要求如下： ①具有大的表面积和足够的吸附能力；

②对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好地分离不同的化学成分； ③在所用的溶剂和展开剂中不溶解；

④不破坏或分解供试品中各组分，不与供试品中溶剂和展开剂起化学反应； ⑤颗粒大小均匀，一般要求直径小于70u．m(小于250目)且在使用过程中不会碎裂；

⑥具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解吸附； ⑦为便于观察分离结果，最好是白色固体。 三、吸附色谱中对流动相的要求

流动相的选择必须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑。在用极性吸附剂进行色谱分离时，当被分离物质为弱极性物质时，一般选

用弱极性溶剂为展开剂；被分离物质为强极性成分时，则需选用极性溶剂为流动相。如果对某一极性物质使用吸附性较弱的吸附剂(如以硅藻土或滑石粉代替硅胶)，则流动相的极性亦必须相应降低。

在薄层色谱中，当吸附剂活度为一定值时(如Ⅱ级或Ⅲ级)，对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。而展开剂的选择原则主要还是根据被分离物质的极性选择相应极性的展开剂。

第二节 分配色谱

一、分配色谱的基本原理

分配色谱法是利用混合物的各个组分在两相溶剂中的分配系数不同而达到分离的一种色谱方法。但需将两相溶剂中的一相，设法固定在某一固体物质上。这样的固体物质，如硅藻土、纤维素粉等，常称为载体。被载体吸收的溶剂，称为固定相。第二相缓慢地在固定相表面上流动，故被称为流动相。然而，这两相必须是平衡以后相互饱和，否则将会在色谱分离过程中出现所用溶剂系统的浓度变化。在色谱过程中，当展开剂流经原点时，被测混合物中的不同物质即在两相之间进行分配，每展开一点距离，被分离物质都接连不断地重复地进行着分配。溶质在固定相中的物质的量浓度与其在流动相中的物质的量浓度之比常称为分配系数，分配系数小的物质，即在流动相中溶解得多的物质，随流动相移动的距离就较大，Rf值大；反之，分配系数大的物质，移动的距离较小，Rf值小。所以经过一定距离展开后，分配系数不同的物质逐渐拉开距离，进而达到分离的目的。一般常用于极性大的成分，如糖、氨基酸、羧酸类、酚类等。

在分配色谱法中的两相系统内，如一相含有机溶剂较多，而另一相含水较多。水相通常固定在固体亲水性载体上，例如硅胶、硅藻土、淀粉、亲水性凝胶、粉状纤维索、滤纸等。有机相通常是流动相，这种方法称为正向色谱法。如果以疏水性材料的载体用有机相浸渍饱和，而水相是流动相的话，那么这种方法就称之为反向色谱法。在一些特殊的情况下，用这种方法可以获得更好的分离效果。 二、分配色谱中对固定相的要求

分配色谱的固定相常被称为载体，最常用的载体有纤维素和硅藻土等。作为分配色谱的载体需要具备以下条件：

①应为中性多孔粉末，对样品组分无吸附性或吸附性极弱。在色谱过程中不溶于

展开剂系统中，与展开剂和样品组分不起化学反应。

②能吸住一定量的固定相，对固定液是惰性的，并不改变其组成，而流动相又能自由通过。

③表面积大，吸住的固定相应尽量多，最好能达到载体重量的50％以上。如硅藻土作为分配色谱的载体效果很好，因为硅藻土可吸收其重量的100％的水，而几乎无吸附性能，它们主要应用于分离蛋白质、核酸、酶、糖等物质，在生化方面应用较多。

三、分配色谱中对流动相的要求

构成分配色谱的溶剂系统种类繁多，一般针对被分离化合物的性质进行选择，大多数是采用复合的溶剂系统，可通过调节溶剂系统的性质，使之与被分离的化合物性质相适应。例如，一个强极性溶剂A与一个弱极性溶剂B混合，通过改变其组成比例，可得到一系列中极性强度的流动相系统。表2—1就是根据被分离化合物的性质得到固定相与流动相之间的关系。

第三节 离子交换色谱

一、离子交换色谱的基本原理

离子交换色谱适用于氨基酸、蛋白质、蛋白质水解物以及其他离子型化合物。以离子交换树脂作为固定相，用水或与水混合的溶剂作为流动相。在流动相中存在的离子性物质与树脂进行离子交换反应而被吸附，代替了因吸附表面活性所产生

的吸附作用。离子交换色谱的分离原理主要表现在以下3个方面： ①利用样品组分的选择性系数不同而进行分离； ②利用各组分解离度的差别而进行分离；

③形成络离子后进行离子交换分离。当树脂的种类、性质和实验条件保持一定以及流动相的各离子强度保持一定时，被分离组分离子在固定相(树脂)和流动相(溶液)之间的浓度之比是一个常数，此常数称为分配系数。分配系数值的大小决定组分离子在树脂上的保留时间，分配系数值大，则溶质的保留时间长。 二、离子交换色谱中对固定相的要求

离子交换树脂分为两大类，即阳离子交换树脂与阴离子交换树脂。离子交换树脂的树脂核是由苯乙烯通过二乙烯基苯链聚合而成。二乙烯基苯在离子交换树脂中所占的重量百分比称为“交联度”。交联度可反映树脂的网眼大小。交联度越大，树脂内的孔洞就越小，大分子物质就不易进入树脂颗粒之内。例如分离氨基酸或小分子肽(二肽或三肽)，以8％交联度的树脂为宜；而对分子量较大的肽，则以选用2％～4％交联度较小的树脂为适宜。一般只要不影响分离的完成，以采用交联度较高的树脂比较适宜。因为交联度高，网眼小，组成紧密，性质较稳定，不易破坏，寿命长。但由于网眼小，分子小的离子可进去，分子大的离子进不去，也就是交换不上，因此表现为交换容量小，而选择性强。

一般情况下，将离子交换树脂按交联度的大小分为三级，根据不同需要选择应用。如制造离子交换水以选用高交联度树脂较好，分离大分子物质则需应用低交联度的树脂，见表2—2。

三、离子交换色谱中对流动相的要求

离子交换色谱展开剂的选择要依据被分离化合物的酸碱性，可用各种类型的缓冲液或盐溶液作为展开剂。选择展开剂的前提是根据被分离化合物是酸还是碱，是阴离子还是阳离子来选择。为了使这些离子型化合物得到较好的分离，点样前必须用水或0．1mol／L氯化钠溶液对薄层板展开一次，即可使离子交换薄层得到

再生或活化。

由于水是优良的溶剂并具有电离性，因此大多数用离子交换树脂进行色谱分离时，都是在水溶液中进行的。有时亦采用水／甲醇混合溶剂，因为在水相展开剂中加入少量能与水混溶的有机溶剂可以增加样品组分的溶解度并且改变溶剂的分离选择性，还可以减少某些组分的拖尾现象。缓冲液用来控制展开剂的pH值，如在阳离子交换树脂中，经常采用醋酸、枸橼酸、磷酸缓冲液；在阴离子交换树脂中，则采用氨水、吡啶等缓冲液。另外也可通过加入某些盐类溶液来调节展开剂的离子浓度。

常用的离子交换色谱展开剂有四种类型：

①pH=3．0～8．0的各种离子强度的缓冲溶液，如pH8．0的0．005mol／L磷酸缓冲液或pH3．4的2mol／L氯化钾或氯化钠溶液； ②盐溶液，如0．1～2．0mol／L氯化钾或氯化钠溶液； ③蒸馏水；

④在上述各种展开剂中加入少量有机溶剂如甲醇、四氢呋喃、乙腈等。

第四节 凝胶色谱

一、凝胶色谱的基本原理

以凝胶为固定相的色谱，称为凝胶色谱。葡聚糖凝胶的分离原理是葡聚糖凝胶在吸水后形成凝胶粒子，在其交联键的骨架中有许多一定大小的网眼。网眼大，大分子物质能进入网眼内；网眼小，只有小分子物质才能进入网眼；而超过一定限度的大分子物质，就被排阻在凝胶粒子的外部而不能进入网眼。这就使得能进入凝胶内部与不能进入凝胶内部的分子，如同按照分子大小过筛一样，所以称为分子筛。操作时首先将凝胶在适宜的溶剂中浸泡，使其充分膨胀，然后再铺成薄层，加入样品后，再以同一溶剂洗脱，则样品中大分子化合物不能进入凝胶颗粒内部，只在凝胶颗粒间移动，因此阻力小，行动快，走在前面；而小分子化合物能自由扩散进入到凝胶内部，因此在色谱时受到的阻力较大，行动慢，走在后面。如此经过一段时间的洗脱，混合物中各组分就会按照分子的大小而获得分离。 二、凝胶色谱中对固定相的要求

凝胶色谱常用的凝胶是葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶常被分为亲水性葡聚糖凝胶、亲脂性葡聚糖凝胶和葡聚糖凝胶离子交换剂三大类。