薄层色谱与薄层扫描

第一章 概 论

第一节 薄层色谱技术的起源及发展

薄层色谱技术又称为薄层层析法，是20世纪50年代从经典柱色谱法及纸色谱法的基础上发展起来的一种平面色谱技术；至20世纪60年代后，人们对薄层色谱法在使用器材的规格、操作方法及术语使用的标准化等方面进行了大量的工作，使该方法日趋成熟和完善，广泛地应用于中药及其制剂中各类化学物质的定性与定量分析。近20年来，人们对薄层色谱法在缩短分离时间、提高分离效率、提高检测灵敏度、保证定量精度及扩大应用范围等方面不断进行研究，取得很大进展。近几年发展起来的现代薄层色谱借助于高科技与计算机技术已发展到仪器化、自动化、计算机化和与其他色谱技术联机化的阶段，可以说是目前众多色谱技术中应用最广、发展最快的一种分离技术。总结薄层色谱技术产生和发展的过程，可以将其分为以下3个阶段。 1．起步阶段

薄层色谱法的起源可以追溯到19世纪末，当时，有人曾用明胶薄层分离盐酸和硫酸，也有人分离酶。其后于1938年由N．A．Izmailor和M．S．Schraiber首次使用在显微镜载玻片上涂布的氧化铝薄层用微量圆环技术分离了多种植物酊剂中的成分，这是目前认为最早的薄层色谱法。以后有少数几篇类似的报道，有的用吸附剂板，有的用浸渍有吸附剂的纸，但进展不大。至1949年

J．E．Meinhard和N．F．Hall报道了以淀粉为黏合剂的氧化铝和硅藻土板进行无机离子的分离，启发了J．G．Kirchner等人使用硅胶为吸附剂，煅石膏为黏合剂，制成较牢固的薄层板，并用类似于纸色谱的上行展开方式，进行了挥发油成分的分离。在此法中可以进行双向展开，也可用显色剂显示无色组分的斑点，这种方式将柱色谱与纸色谱的优点结合在一起，奠定了薄层色谱的基础。1951～1954年发表了一些研究报告，此时Kirchner将其称之为“色谱条”

(chromatostrip)，R．H．Reitsema则将其称之为“色谱板”(chromato—plate)。经过了近半个世纪的摸索，现已初步形成了用薄层色谱板进行成分分析的薄层色谱法。

2．推广普及阶段

20世纪50年代薄层色谱法已初具规模，但此法得到普遍承认和使用则还是

1956～1958年以后的事。在此期间，E．Stahl进行了较系统的研究，在吸附剂硅胶的规格、性能、薄层厚度等对于分离的影响筹方面得到了总结性的结论，而生产厂家联邦德国的Desage和Merck也开始供应薄层分离用的硅胶和涂布薄层的涂布器及其他有关设备，使分离结果的重现性得到较好的保证。尤其是在Stahl的《薄层色谱手册》一书于1965年出版后，薄层色谱技术得以宣传介绍，从此被广泛使用，并正式采用了薄层色谱法的名称，由欧洲向世界各地推广，应用方法日趋成熟和完善。此时，我国的医药学界也开始推广使用薄层色谱法，并利用该项技术对中药中各类化学物质进行定性与定量分析。 3．发展提高阶段

20世纪80年代以前，色谱法开始是以一种分离方法出现的。复杂的混合物通过装有吸附剂的柱管可以被分离成一条条的色带，从而可以取下、溶出、获得纯的组分。其后经过近几十年的发展，薄层色谱法逐渐成熟，进而成为一门专门学科。它集分离、分析于一体，简便、快速、微量，成为分离分析复杂混合物的理想方法之一，在许多科学领域中得到广泛应用。例如，各国药典收载的天然药物及其制剂采用薄层色谱鉴别的品种超过50％的即有德国、法国、英国、瑞士及欧洲药典等。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)1990年版开始采用薄层色谱法进行鉴别的品种数目逐版大幅度增加。薄层色谱法在国家标准中及新药研制中的大量应用，充分证实了该方法对于鉴别成分复杂的中药是简便有效的手段，它解决了许多其他分离分析方法所不能解决的难题，有力地推动了中药鉴别水平的发展和提高，同时因为该项技术在其他领域的广泛使用，也有力地推动了医药、卫生、生化、天然有机化学等其他学科的发展和提高，在科学技术进步的历程中，起到了较大的推动和促进作用。特别是近年来借助于高科技与计算机技术的介入，薄层色谱技术已在原有基础上进人了仪器化、自动化、计算机化和与其他色谱技术联机化的快速发展和提高阶段。随着薄层色谱技术的不断完善，在今后的中药分析的研究工作中，将具有更为广阔的应用前景，将会做出更大的贡献。

第二节 薄层色谱技术的特点和演变历程

一、薄层色谱技术的特点

薄层色谱技术具有其他色谱技术共同的特征，即利用样品中各组成成分的不同物

理特性把它们分离开来。这些物理特性包括分子大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性等。 1．薄层色谱系统的组成部分

固定相：可以是一种固体、凝胶或固定化的液体，或起支撑作用的基质。 色谱板：把固定相薄薄涂布在玻璃或塑料板上。

流动相：又称展开剂，起溶剂作用的液体，用于协助样品在固定相表面以不同速度进行迁移。

运送系统：用来促使流动相通过色谱床。薄层色谱的运送过程是借助毛细管作用、压力或者离心力等设备。

检测系统：用于检测所分离的物质。 2．薄层色谱技术的特点

①色谱系统所用器材简单，价格低廉，操作技术易学，容易在一般实验室推广。 ②不受样品种类的限制，适用范围较广。不仅可用于复杂成分的分离，还可用于未知成分的分离和检测。并且检测可用的手段选择性多，较为方便。 ③具有多路柱效应，可同时进行多个样品的分离，且灵敏度高、检测速度快。 ④样品前处理比较简单，精度要求不高，还可直接用样品的粗提物点样。实验时溶剂用量少，更换容易，实验成本较低。

⑤在获得典型色谱图后，既可以直接扫描进行测定，也可通过彩色摄影制成彩色图谱或利用计算机图像处理系统进行处理后作为规范文件永久保存。 二、薄层色谱技术发展演变历程

薄层色谱法是20世纪50年代从经典柱色谱法及纸色谱法的基础上发展起来的一种色谱技术。进入20世纪60年代后，人们对薄层色谱法在使用器材的不断改进、操作技术水平的不断提高等方面进行了大量的工作，如薄层板的制备和点样装置的从手工逐步过渡到自动，从人工控制到机械化自动控制，使薄层色谱法的操作精度日益提高，因而也就为该项技术在中药及其制剂中各类化学物质的定性与定量分析中的广泛应用提供了技术支持条件。特别是在近20年来，随着计算机技术的不断渗透，人们对薄层色谱法在缩短分离时间、提高分离效率、提高检测灵敏度、保证定量精度及扩大应用范围等方面不断进行研究，使该方法不仅在仪器设备上不断完善，而且在技术水平上取得了突破性进展。主要有以下几个方面的

突出表现。

第一方面，薄层色谱与其他分离分析技术联用，更加拓宽了薄层色谱技术的适用范围。比如，与其他色谱法联用从而产生了薄层色谱与高效液相色谱法联用、薄层色谱与气相色谱联用、HPLC-GC／MS-TLC联用、高速反流色谱与薄层色谱联用等技术。这些联用技术有效地解决了一些组成复杂而含量又极微的化学成分分离的技术难题。

第二方面，薄层色谱与其他分析检测仪的联用，增加了分析检测的准确性和精密度。这样不仅可以强化其定性的功能，而且还可以对样品中被分离的一种或多种成分进行在线联用定量分析，这与以往将斑点从薄层上刮下后再与各种光谱联用相比，其准确性和精密度都有显著提高。比如，薄层色谱--紫外可见光谱扫描仪(如Camag II型薄层扫描仪／HP300计算机系统)，在光源允许的范围内，可选择多达9种波长，依次自动扫描，从而获得三维光谱的薄层色谱图，人们可以利用不同颜色绘制的三维图，直观地看到各组分在不同波长的吸光强度及其变化情况，选定波长时同时扫描测定样品中各成分的含量。此外，还有薄层色谱法与光谱法联用而产生的薄层色谱与原子吸收光谱联用、薄层色谱与红外光谱联用、薄层色谱与拉曼光谱联用、薄层色谱与光声光谱联用、薄层色谱与质谱联用、薄层色谱与核磁共振联用和薄层色谱与数字自动化放射自显影联用等技术。通过这些技术的联用，人们可以获取丰富的被测化合物的结构信息，也使薄层色谱的定性功能得到了进一步的加强。类似这样的联用技术还包括与电化学法联用而出现的薄层色谱法与方波阳极伏安法联用、薄层色谱法与脉冲极谱法联用、薄层色谱与库仑滴定法联用等技术，它们在解决复杂的中药化学成分检测的问题方面均获得了满意的结果。

第三方面，薄层色谱照相技术是近几年发展起来的一项专业摄影技术，主要是对经过色谱的薄层板，在灯光(日光)或一定波长的紫外光下，将可见光或荧光斑点完整地以照片形式记录下来，从而得到一张永久性的薄层色谱图，它记录了薄层色谱的所有信息。近年来利用数码技术直接将图像信息输入计算机内进行储存和打印，不仅提高了薄层图像的质量，而且还保证了薄层色谱数据资料的规范性。

第三节 薄层色谱技术的应用

一、薄层色谱法在中药方面的应用

众所周知单味中药除有效成分外，还含有大量的其他成分，由多味中药制成的中成药，其成分更为复杂，要在大量杂质存在下，检出微量的一种或多种有效成分，其难度之大是可以想像的。过去只能测定某种药材中生物碱、黄酮、皂苷等成分的总含量，自从薄层色谱被采用以来，几乎成了分析中药及其制剂的首选方法。在这方面我国药物分析工作者做了大量的工作，主要表现在中药材品种的真伪鉴别、中药及其制剂的质量标准的研究、中药资源调查和品质评价以及中药的安全性检测等方面。目前，国家标准要求制定的中药注射剂指纹图谱中就包括有组成处方的中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱等内容。其中有些中药的指纹图谱就是利用薄层色谱法制定的。 二、薄层色谱法在西药方面的应用

利用被鉴别化合物的Rf值、斑点的颜色及原位光谱扫描等可作为药物的鉴别方法之一，因为方法简便易行，故应用非常广泛，也常被各国药典采用。我国也不例外，同样也充分利用薄层色谱技术进行了多方面的研究和应用。比如，药物成分的鉴定及含量测定、合成工艺监控及反应机制的研究、稳定性考察、药物代谢研究、生化与抗生素研究等。薄层色谱已成为药学研究中不可缺少的技术之一。 三、薄层色谱法在其他方面的应用

生物样品与毒物分析、对环境有害物质的分析、食品分析、无机及金属有机化合物分析、染料及化妆品的分析、石油和煤的分析、手性化合物的分离、化工及高分子材料分析方面的应用都获得了成功，可以说薄层色谱技术渗透了人们日常生活的方方面面。

第二章 薄层色谱技术的基本原理

薄层色谱，与其他色谱技术的原理一样，是一种利用样品中各组成成分的不同物理特性把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性等。薄层色谱分离一般是由几种分离机理综合的结果，最多的是吸附和分配，也有离子交换或凝胶渗透。鉴于在薄层色谱的过程中，固定相和流动相的特性因分离原理的不同而差别较大，因此，为了方便叙述，现分别将各类型的色谱基本原理以及相关固定相和流动相的技术要求简要介绍如下。