从江香猪源干扰素α2、β在生菜中的瞬时表达及其对
PRRSV复制抑制作用的研究
田 浪1,2，温贵兰1,2*，张升波1,2，杨佰启1,2，李昌红1,2，徐 丽1,2，陈 广1,2，张喜懿1,2，龚新勇1,2，陈彦希1,2，文 明1,2
【摘 要】为在生菜中瞬时表达从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β和IFN-β，检测其抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的活性，本实验采用从江香猪源干扰素特异引物分别从 pUCm-CJpoIFN-α2、pUCm-CJpoIFN-α2β、pUCm-CJpoIFN-β质粒中扩增IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β基因序列，分别克隆至植物表达载体pBI121中，构建含不同干扰素的重组质粒。将各质粒分别转化根癌农杆菌LBA4404，采用真空渗透法将携带重组质粒的根癌农杆菌感染生菜，经用GUS染色和ELISA方法检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达；用qPCR方法和细胞病变抑制试验检测生菜中表达的从江香猪源干扰素蛋白抗PRRSV的活性。结果显示：本实验构建了含从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β 的植物表达载体 PBI121-IFN-α2、PBI121-IFN-α2β、PBI121-IFN-β；GUS 染色和 ELISA检测结果显示从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中实现了瞬时表达；qPCR检测结果显示生菜中瞬时表达的从江香猪源干扰素蛋白在Marc145细胞中对PRRSV的复制有明显抑制作用；生菜中表达的从江香猪源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β分别经47、49、47稀释在Marc145细胞中仍然能够抑制100 TCID50PRRSV的致细胞病变作用。本实验实现从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中的瞬时表达且表达蛋白具有较强抑制PRRSV的复制作用，本研究为从江香猪源干扰素抗PRRSV新复合型药物蛋白的开发利用提供参考依据。
【期刊名称】《中国预防兽医学报》 【年(卷),期】2024(041)007 【总页数】6
【关键词】从江香猪源干扰素；生菜；瞬时表达；猪繁殖与呼吸综合征病毒 基金项目：国家自然科学基金(31460668)；贵州省科学技术基金(黔科合J字[2015]2046)；贵州省高层次创新型人才培养(黔财教[2017])；贵州大学博士基金([2013]12)；贵州省科技平台及人才团队计划(黔科合平台人才[2024]5253)；贵州省研究生工作站计划项目(GZZ2017002)
目前我国养猪业已经形成较大的规模，但由于高密度的养殖、环境的恶化和抗生素的滥用等因素，猪感染的病毒病也越来越多。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒引起的猪一种繁殖障碍和呼吸系统高度接触性传染病，被认为是影响养猪业健康发展的重要疾病之一，目前尚无特效药治疗PRRS，因此研制高效、经济、安全的抗PRRSV新型药物制剂显得非常重要。
干扰素(Interferon，IFN)是在特定的诱生剂作用下，由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，具有广谱抗病毒活性[1]。IFN本身并非直接抗病毒物质，不直接与靶分子作用，而首先要与靶细胞表面的特异性受体相结合，通过信号传递，引发一系列特定的生化反应，刺激细胞内多种效应蛋白质分子合成，从而发挥IFN的活性功能[2]。猪IFN-α、猪IFN-β属于IFN-I，具有重要的抗病毒生物学活性。已有研究人员在毕赤酵母或杆状病毒中表达了猪IFN-α，表达蛋白对PRRSV、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型具有抑制作用[3-5]；在毕赤酵母表达了猪IFN-β，表达蛋白对伪狂犬病毒、
PRRSV、水泡性口炎病毒具有抑制作用[6-8]。
从江香猪主产于贵州省从江县，属于中国稀有微型的地方优良品种猪，其具有基因纯合、近交不退化、适应性强和抗病力强等优良特点，是猪相关疾病研究的理想动物模型，有着较高的研究价值[9]。温贵兰等报道从江香猪源IFN-α2核苷酸序列与猪源IFN-α2核苷酸序列同源性为98.7%，同时存在7处碱基的变异，前者推导的氨基酸序列与后者存在4处差异；从江香猪IFN-β基因核苷酸序列与其它猪源IFN-β基因同源性为99.5%～100%，其氨基酸序列与巴马猪、梅山猪IFN-β的氨基酸序列同源性均为100%，但与贵州白香猪IFN-β的氨基酸序列同源性为99.5%，存在E43Q、K73R和C16R 3处氨基酸差异[10-11]。到目前为止，尚未见融合从江香猪源IFN-α2、IFN-β于生菜中瞬时表达并对瞬时表达蛋白进行抗病毒活性研究的相关报道。本实验构建了含从江香猪源 IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β 的植物表达载体并转化根癌农杆菌LBA4404，采用根癌农杆菌渗透法感染生菜，对瞬时表达的从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β 蛋白进行抗 PRRSV 活性研究，以期为从江香猪源IFN抗PRRSV新复合型药物的开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料 含从江香猪源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β的质粒pUCm-CJpoIFN-α2、pUCm-CJpoIFN-β、pUCm-CJpoIFN-α2β 以 及 PRRSV GZBJ201712 株 、Marc 145细胞、PK15细胞均由本实验室保存；新鲜生菜购自贵州省花溪区某农贸市场。
根癌农杆菌LBA4404感受态细胞购自上海维地生物技术有限公司；无内毒素质粒小提中量试剂盒、TRIzol试剂、SmaⅠ、XbaⅠ、DL2000 DNA Marker、
从江香猪源干扰素α2、β在生菜中的瞬时表达及其对PRRSV复制抑制作用的研究
