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Continued
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0 0 0 0 0 0 0
?1 1 0 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0 0
3 4.1 5.6 5.6 5.2 4.9 5.2
Box Behnken设计的方差分析见表7，模型的拟合度可通过决定系数来衡量，Joglekar和May建议，一个良好的模型，决定系数至少为0.80，该模型的决定系数为0.9691，且回归模型极显著(p < 0.01)，因此，该模型能充分地表明各因素之间的关系。
Table 7. Analysis of variance of the regression parameters for Box Behnken design model 表7. Box Behnken模型设计方差分析表
方差来源 模型 E-葡萄糖 F-牛肉膏 G-酵母膏 EF EG FG E2 F2 G2 残差 失拟项 纯误差 总回归 决定系数R2 校正决定系数AdjR2
平方和 12.71 0.02 1.81 0.41 0.42 1.32 0.01 0.08 2.61 5.46 0.41 0.05 0.36 13.12 0.9691 0.9294
自由度 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16
均方 1.412255 0.02 1.81 0.41 0.42 1.32 0.01 0.08 2.61 5.46 0.06 0.02 0.09
F值 24.41 0.35 31.20 7 7.30 22.86 0.04 1.38 45.13 94.16 0.17
P值Prob > F 0.0002 0.5750 0.0008 0.0331 0.0305 0.0020 0.8412 0.2792 0.0003 <0.0001
0.9136
显著性
** ** * * ** ** **
注：p < 0.0100极显著(**)；p < 0.0500显著(*)；p > 0.0500不显著。
根据方差分析和回归方程系数显著性检验的结果，将差异不显著的因子剔除后得到的回归方程为：
Y=?195.35+464.75F+105.88G+26EF+23EG?315F2?113.75G2
由表7方差分析可知，失拟项P = 0.9136 > 0.05，差异不显著，说明残差由随机误差引起；复相关系拟合度>90%，说明模型能够反应响应值变化，R为0.9844，表明实测值和预测值高度相关；R2为0.9691，试验误差小，可以用此模型培养基主要成分进行分析和预测。
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3.3.1. 自变量对响应值的影响
回归方程的回归系数影响菌体数量，由表7可知，F、G、EF、EG、F2、G2项对菌体数量有显著影响，其他因素影响不显著。回归方程一次项的回归系数绝对值大小依次为F、G、E，表明牛肉膏添加量对菌数的影响最大，其次为酵母膏添加量、葡萄糖添加量。 3.3.2. 葡萄糖添加量与牛肉膏添加量对菌体数量的影响
由图1可知，葡萄糖添加量与牛肉膏添加量对菌体数量的交互作用。当其他条件一定时，菌体数量随着葡萄糖添加量的提高而下降，随着牛肉膏添加量的提高呈现先上升后下降的趋势，当葡萄糖添加量在15 g/L、牛肉膏添加量在8 g/L附近时菌体数量达到最大，此时牛肉膏添加量对菌体数量的影响极显著(p < 0.01)，葡萄糖添加量影响不显著(p > 0.05)，两者交互作用显著(0.05 < p < 0.01)。这是因为15 g/L葡萄糖能够提供菌体生长的C源，过多的葡萄糖反而抑制菌体生长。
Figure 1. Response surface plot of cell number versus glucose and beef extract 图1. 葡萄糖与牛肉膏交互作用对菌体数量影响的响应面
3.3.3. 葡萄糖添加量和酵母膏添加量对菌体数量的的影响
由图2可知，葡萄糖添加量与酵母膏添加量对菌数的交互作用。在一定条件下，菌数随着酵母膏添加量提高呈现先上升后下降的趋势，当葡萄糖添加量大于17.5 g/L时，菌体数量的增长趋于平缓，随着葡萄糖添加量的提高呈现下降的趋势，葡萄糖添加量、酵母膏添加量交互作用极显著(p < 0.01)，酵母膏添加量对菌数的影响显著(0.01 < p < 0.05)。
Figure 2. Response surface plot of cell number versus glucose and yeast extract 图2. 葡萄糖和酵母膏对菌体数量影响的响应面
3.3.4. 牛肉膏添加量和酵母膏添加量对菌体数量的影响
由图3可知，牛肉膏添加量和酵母膏添加量对菌体数量的交互作用。当其他条件一定时，菌体数量
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随着牛肉膏添加量和酵母膏添加量的提高呈现先上升后下降的趋势，当牛肉膏添加量在8 g/L、酵母膏添加量在6.5 g/L附近时菌体数量达到最大，牛肉膏添加量对菌数的影响极显著(p < 0.01)，酵母膏添加量对菌数的影响显著(0.01 < p < 0.05)，两者交互作用不显著(p > 0.05)。
Figure 3. Response surface plot of cell number versus yeast extract and beef extract 图3. 牛肉膏和酵母膏对菌体数量影响的响应面
3.3.5. 最佳条件的确定与验证
通过Design Expert 7.0软件分析，得出培养基主要成分添加量为：葡萄糖20 g/L，牛肉膏8.3 g/L，酵母膏6.9 g/L，预测最优值为5.56 × 108 cfu/mL。3次重复试验以优化，其检测结果为5.4 × 108 cfu/mL，与真实值的相对误差为2.88%＜5%，表明所优化的最佳条件合理可靠的，验证了所建模型的正确性。故，浅黄假单胞菌C3菌株的最优培养基配方为：葡萄糖20 g/L，MgSO4 0.2 g/L，牛肉膏8.3 g/L，酵母膏6.9 g/L，K2HPO4 1 g/L，CaCO3 1 g/L。
4. 讨论与结论
在优化培养基的过程中，Plackett-Burman设计能够从繁密的培养基组成成分中选择出对目标产物影响较为明显的因子，而响应面分析法能够同时对响应值的几个变量进行回归分析，可以阐明多种因素之间的交互作用，并且可以根据回归方程推算响应值的最优值。而今，全球众多学者采用此方法对各种微生物培养基尝试了优化，均获得了较为理想的实验结果。
利用Plackett-Burman设计，在浅黄假单胞菌C3的基础发酵培养基中筛选出3个显著因子，分别是葡萄糖(X1)、牛肉膏(X3)和酵母膏(X4)，以爬坡实验迅速逼近最大响应值的稳定响应区，再运用Box-Behnken设计得出3个显著因子的最优配比，最终明确最优培养基配方为：葡萄糖20 g/L，MgSO4 0.2 g/L，牛肉膏8.3 g/L，酵母膏6.9 g/L，K2HPO4 1 g/L，CaCO3 1 g/L。通过验证实验检测结果为5.4 × 108 cfu/mL与预测值相近，明确得出该模型拟合实验结果的有效性和准确性。
对引起薄皮甜瓜采后病害主要病原真菌具有拮抗作用的生防菌株浅黄假单孢菌(Pseudomonas luteola)牛肉膏8.3 g/L，酵母膏6.9 g/L，K2HPO4 1 g/L，实验室发酵的最佳培养基为：葡萄糖20 g/L，MgSO4 0.2 g/L，CaCO3 1 g/L。
基金项目
黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(GZ13B011)。
参考文献
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利用响应面法摸索薄皮甜瓜采后病害生防菌株发酵最佳培养基 - 图文
