利用响应面法摸索薄皮甜瓜采后病害生防菌株发酵最佳培养基 - 图文

Hans Journal of Agricultural Sciences 农业科学, 2020, 10(8), 571-579

Published Online August 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/hjas https://doi.org/10.12677/hjas.2020.108087

Using Response Surface Methodology to Explore the Best Fermentation Medium for Biocontrol Strain for Post-Harvest Diseases of Melon

Xu Cao1,2, Liang Shang1, Jingyu Chen1, Liqiang Meng1,2, Jing Li1,2*

12

Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin Heilongjiang Institute of High Technology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin Heilongjiang

Received: Jul. 24th, 2020; accepted: Aug. 7th, 2020; published: Aug. 14th, 2020

Abstract

Aim: To study the best culture medium for laboratory fermentation of the biocontrol strain Pseu-domonas lutea, which has a preventive effect on the postharvest diseases of muskmelon, and then provide high-quality resources for the application and development of microbial pesticides. Me-thods: Plackett-Burman and Box-Behnken design experiments using Design-Expert 8.0 software. Results: The optimal medium for laboratory fermentation of the biocontrol strain Pseudomonas luteola, which has antagonistic effect on the main pathogenic fungi that cause the postharvest dis-eases of muskmelon, was determined as: Glucose 20 g/L, MgSO4 0.2 g/L, beef extract 8.3 g/L, yeast extract 6.9 g/L, K2HPO4 1 g/L, CaCO3 1 g/L.

Keywords

Fermentation, Pseudomonas luteola, Response Surface

利用响应面法摸索薄皮甜瓜采后病害生防菌株发酵最佳培养基

曹 旭1,2，商 亮1，陈静宇1，孟利强1,2，李 晶1,2*

1

黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 2

黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江 哈尔滨

*通讯作者。

文章引用: 曹旭, 商亮, 陈静宇, 孟利强, 李晶. 利用响应面法摸索薄皮甜瓜采后病害生防菌株发酵最佳培养基[J]. 农业科学, 2020, 10(8): 571-579. DOI: 10.12677/hjas.2020.108087

曹旭 等

收稿日期：2020年7月24日；录用日期：2020年8月7日；发布日期：2020年8月14日

摘 要

目的：研究对薄皮甜瓜采后病害具有防治作用的生防菌株浅黄假单胞菌的实验室发酵最佳培养基，为微生物农药应用开发提供优质资源。方法：采用Design-Expert 8.0软件的Plackett-Burman及Box- Behnken设计试验。结果：确定了对引起薄皮甜瓜采后病害主要病原真菌具有拮抗作用的生防菌株浅黄假单孢菌(Pseudomonas luteola)实验室发酵的最佳培养基为：葡萄糖20 g/L，MgSO4 0.2 g/L，牛肉膏8.3 g/L，酵母膏6.9 g/L，K2HPO4 1 g/L，CaCO3 1 g/L。

关键词

发酵，浅黄假单孢菌，响应面

Copyright ? 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Open Access 1. 引言

黑龙江省是我国薄皮甜瓜主要生产基地，由于生产上市期过于集中，形成短期积压，极易受采后致腐性真菌侵染腐烂变质，成为我国薄皮甜瓜销售储运产业的严重障碍[1] [2]。且甜瓜采后病害在世界各甜瓜产区均有发生已为全球性问题[3]，亟待研究解决。

目前，化学杀菌剂是防治果蔬采后病害的主要方法[4]，但随着当今社会对健康问题逐步关注，以及绿色食品知识的普及和农药残留问题的突出[5]，使得探寻一种安全有效抑制果蔬采后腐烂的方法变得尤为重要，而采后病害生物防治技术能减少甜瓜储藏运输期间的变质，为无毒、无农药残留的采后病害控制提供了一种重要的方法[6] [7] [8]。

笔者前期已筛选到一株具有防治薄皮甜瓜采后病害的生防菌株[9]，而为了将“绿色防腐”技术应用于薄皮甜瓜采后病害的防治实践当中，本研究将探索其最佳的发酵培养基，意为人们提供品质优良、绿色安全、可延长保存期的生防菌剂。

2. 材料与方法

2.1. 供试菌株

浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola) C3 [9]由黑龙江省生物工程重点实验室自薄皮甜瓜表面分离。

2.2. 培养基

发酵初始培养基：葡萄糖10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母膏5 g/L，pH 7.2~7.5。湿热灭菌：121℃，20 min。将浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola) C3接于装液量20 mL的250 mL容量的三角瓶培养基中，30℃、90 r/min、15 h培养。再以2%接种量接种于装液量50 mL的三角瓶发酵培养基中，30℃、160 r/min培养20 h。

DOI: 10.12677/hjas.2020.108087

572

农业科学

曹旭 等

利用平板菌落计数法，将发酵液按梯度稀释至10?5、10?6，取10 μL涂布，置于30℃培养，将个数在30~300之间的菌落个数视为有效值即响应值，其中每毫升菌液中活菌的个数(cfu/mL) = 同一稀释度3次重复的平均菌落数 × 稀释倍数 × 103/取样量。

2.3. Plackeet-Burman设计筛选影响菌体浓度的显著性因子

筛选基础发酵培养基中的显著因子，对影响菌株发酵浓度的最佳组成的6个因子，即葡萄糖(X1)、MgSO4 (X2)、牛肉膏(X3)、酵母膏(X4)、K2HPO4 (X5)、CaCO3(X6)，进行全面考察。选择6因子2水平的试验设计，每个因子取高低两个水平，且高水平是低水平的2倍，见表1，拟合方程为：

W=γ0+γ1X1+γ2X2+γ3X3+γ4X4+γ5X5+γ6X6

Table 1. Factors and levels of Plackett-Burman design

表1. Plackett-Burman设计因子与水平

水平(g/L)

符号 X1 X2 X3 X4 X5 X6

因子

?

葡萄糖 MgSO4 牛肉膏 酵母膏 K2HPO4 CaCO3

10 0.2 5 5 0.5 0.5

+ 20 0.4 10 10 1 1

2.4. 最陡爬坡实验

确定影响菌株发酵浓度的显著性因子，根据回归方程各因子的系数来明确主要因子的爬坡路径和步长[7]，以快速逼近曲面的稳定点区域。

2.5. 响应面实验设计

通过Plackett-Burman实验确定影响菌株C3发酵菌体浓度的主要因素，进而由最陡爬坡实验逼近影响菌体发酵浓度响应面稳定区域。利用Box-Behnken中心组合设计方法，在主要因子的响应区分别取3个水平，设计一个3因素3水平的响应面分析试验。

2.6. 数据分析

每处理中含有3个平行试验，取平均值。运用Design-Expert 8.0完成Plackett-Burman设计、Box-Behnken设计的响应面分析。

3. 结果与分析

3.1. 影响菌体浓度的显著性因子

采用Plackett-Burman设计对主要因素的6个因子进行考察，各组分分别取高水平(+1)和低水平(?1)，见表2；各因子水平方差分析结果见表3。

DOI: 10.12677/hjas.2020.108087

573

农业科学

曹旭 等

Table 2. Plackett-Burman design and response results 表2. Plackett-Burman设计及响应值

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A ?1 1 1 1 ?1 ?1 ?1 ?1 1 ?1 1 1

B ?1 ?1 1 ?1 ?1 1 1 1 1 ?1 ?1 1

C ?1 1 1 1 1 1 1 ?1 ?1 ?1 ?1 ?1

D 1 1 ?1 1 ?1 ?1 1 1 ?1 ?1 ?1 1

E ?1 ?1 ?1 1 ?1 1 ?1 1 ?1 ?1 1 1

F 1 1 ?1 ?1 1 1 ?1 ?1 1 ?1 ?1 1

活菌数(108 cfu/mL)

3.8 4.6 6.1 4.7 4.7 5.1 3.5 3.3 5.4 4.0 5.7 3.9

Table 3. The levels of Placket-Burman and analysis of variance for regression model 表3. Placket-Burman实验水平及回归模型方差分析

因素来源 Model X1-葡萄糖 X2-MgSO4 X3-牛肉膏 X4-酵母膏 X5-K2HPO4 X6-CaCO3

平方和 7.89 3 0.01 0.56 4.32 0 0.01

均方 1.31 3 0.01 0.56 4.32 0 0.01

F 7.68 17.51 0.019 3.28 25.21 0 0.019

p-value Prob > F

0.0205 0.0086 0.8945 0.1295 0.0040 1.0000 0.8945

重要性

2 5 3 1 6 4

由表3可知，培养基中各因子菌株对C3发酵液活菌浓度影响的重要性排序为：X4 > X1 > X3 > X6 > X2 > X5。即酵母膏、葡萄糖和牛肉膏的影响比较明显，酵母膏对于菌体数量呈现负效应，而葡萄糖和牛肉膏呈正效应。即W=4.25+X1?0.03X2+0.87X3?2.4X4+2.56×10?14X5+0.67X6，方程R2 = 0.9021，表明该回归方程拟合良好。从方程中还可以看出，要提高菌体数量，应适当降低酵母膏添加量，提高葡萄糖和牛肉膏添加量。

3.2. 最陡爬坡试验研究最大响应值的响应区域

利用爬坡实验快速逼近最大响应值稳定响应区，根据Plackett-Burman试验设计筛选出的主要组分的效应大小设计步长，进行最陡爬坡试验设计，寻找最优菌数。如表4所示，第2组试验发酵菌体浓度最大，即当葡萄糖浓度为17.5 g/L，牛肉膏浓度为8 g/L，酵母膏浓度为6.5 g/L时发酵菌液浓度达到最大值，故以此为中心点进行响应面试验分析。

DOI: 10.12677/hjas.2020.108087

574

农业科学

曹旭 等

Table 4. Steepest ascent procedure and corresponding results 表4. 最陡爬坡试验设计及结果

试验号 1 2 3 4 5

葡萄糖(g/L)

15 17.5 20 22.5 25

牛肉膏(g/L)

7.5 8 8.5 9 9.5

酵母膏(g/L)

7.5 6.5 5.5 4.5 3.5

活菌数(108cfu/mL)

3.3 5.4 4.2 3.1 2.4

3.3. 响应面试验数据分析

根据爬坡试验结果，采用Box Behnken模型，以葡萄糖、牛肉膏和酵母膏为主要考察因子，以+1、0、?1分别代表自变量的高、中、低水平，以发酵液活菌数为响应值，通过响应曲面分析(RSM)进行培养基主要成分的优化。因子编码及水平如下，见表5。

Table 5. Factors and levels of Box-Behnken design 表5. Box-Behnken设计因子代码与水平

符号 E F G

因子 葡萄糖 牛肉膏 酵母膏

水平(g/L)

?1 15 7.5 5.5

0 17.5 8 6.5

1 20 8.5 7.5

通过Box Behnken模型进行三因素三水平试验设计，见表6。利用Design Expert 8.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到了菌体数量为响应值Y对葡萄糖E、牛肉膏F、酵母膏G的二次多项回归模型方程为：

Y=?195.35?27.85E+464.75F+105.88G+26EF+23EG+5FG?2.2E2?315F2?113.75G2

Table 6. Box Behnken design and response values

表6. Box Behnken模型设计和响应值

试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

E ?1 1 ?1 ?1 0 1 ?1 1 0 0

F ?1 ?1 1 0 0 0 0 0 ?1 1

G 0 0 0 ?1 0 ?1 1 1 ?1 ?1

活菌数(108cfu/mL)

4.2 3.7 4.4 5.2 4.3 3.2 3.7 4.9 2.7 3.7

DOI: 10.12677/hjas.2020.108087

575

农业科学