分钟（3000r/min）10分钟 。 弃去清夜 保留沉淀（即为胰凝乳蛋白酶） （1） (2) （3） （4） （5） 编号 蒸馏水（ml） 碱性铜溶液（ml） 蛋白质原液（ml） 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0 1 － 2.0 2 － 2.0 3 (3)液2.0 － 2.0 4 蒸馏水（ml） 9.6 9.5 9.4 9.2 9.0 5 (5)液2.0 － 2.0 6 (6)液2.0 2.0 2.0 取6支试管，编号，按下表操作。 标准样品（ml） (1液2.0 (2)液2.0 (4)液2.0 － 2.0 混匀后于室温中放置20分钟 酚试剂（ml） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混匀各管，30分钟后，以第6管为空白管（光茎0.5cm），在A680nm处读取吸光值。 按凯式定氮法测定的蛋白质含量，算出各管的蛋白质浓度，以此为横坐标，各管的光吸收值为纵坐标作图，得标准曲线。 （2）测定样品蛋白质含量 将胰凝乳蛋白酶提取液A、0.6饱和度硫酸氨制得的胰凝乳蛋白酶B、胰凝乳蛋白酶溶液C，分别用pH7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释适当倍数。 取4支试管，编号，按下表操作。 管号 样品（ml） 蒸馏水（ml） A 2.0 － B 2.0 － 2.0 0.2 C 2.0 － 2.0 0.2 对照 2.0 － 2.0 0.2 碱性铜溶液（ml） 2.0 酚试剂（ml） 0.2 混匀后于室温中放置20分钟 立即混匀，放置30分钟，测定A680nm的光吸收值。用A/B/C各管的光吸收值分别减去对照的光吸收值，然后查蛋白质标准曲线，得出每ml稀释样品的蛋白质含量，再计算处A、B、C3种制剂每ml中蛋白质的含量。
（2）样品中胰凝乳蛋白酶活力的测定 A制备标准曲线，按下表加液。 管号 酪氨酸标准液 0.1mpl/LNaOH 碱性铜溶液 酚试剂 1 ①2.0 2.0 2.0 0.2 2 ②2.0 2.0 2.0 0.2 3 ③2.0 2.0 2.0 0.2 4 ④2.0 2.0 2.0 0.2 5 ⑤2.0 2.0 2.0 0.2 对照 水2.0 2.0 2.0 0.2 混匀，放置30分钟，测定A680nm的光吸收值。以光吸收值为纵坐标，酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。
精选
B 样品中胰凝乳蛋白酶活力的测定 将上述3种制剂分别pH7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释适当倍数。
取4支试管，编号，按下表操作。 管号 1％酪蛋白液（ml） pH7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液（ml） 样品（ml） 10％三氯醋酸（ml） 放置10分钟后过滤。
取4支试管，编号，按下表操作。 管号 滤液（ml） 0.1mol/LNaOH溶液（ml） 碱性铜溶液（ml） 酚试剂（ml） A 2.0 2.0 2.0 0.2 B 2.0 2. 0 2.0 0.2 C 2.0 2.0 2.0 0.2 对照 2.0 2.0 2.0 0.2 A 1.0 1.0 1.0 2.0 B 1.0 1.0 1.0 2.0 C 1.0 1.0 1.0 2.0 对照 － 2.0 1.0 2.0 摇匀，放入25℃水浴中10min 摇匀，继续保温10分钟 混匀，放置30分钟，测定A680nm的光吸收值。将各管的光吸收值减去对照管的光吸收值，然后查标准曲线，算出每ml胰凝乳蛋白酶稀释液的活力单位数。 (3)计算 比活力＝胰凝乳蛋白酶活力单位数/蛋白质mg数
测定蛋白质含量(参照前面学习蛋白质测定的方法)
双缩脲（Biuret）法
在碱性溶液中，蛋白质分子能与铜离子结合生成紫红色的化合物（双缩脲反应），在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线形关系。因此可用比色法测定蛋白的含量。 福林—酚试剂法：
a 福林—酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸和磷钨酸的混合试剂 b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应
c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨
蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质成正比。
紫外线吸收法
蛋白质中的Tyr、Try在280nm左右具最大吸收，且在各种蛋白质中Tyr、Try含
量差别不大，280nm吸收值与浓度具正相关
实验九、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
一、 目的
1、了解聚丙烯酰胺电泳的基本原理和操作技术。
精选
2、掌握聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直板/圆盘电泳分离血清蛋白质的方法。了解该电泳的特点及适用范围。 二、 原理
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化刘和加速剂的作用下发生聚合反应而制得的。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度来加以控制。一般分离蛋白质选取用7.5%聚丙烯酰胺凝胶，分离比较大的分子，如核糖体核酸时则用2.5%凝胶。凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用其分辨力较高。 三、 器材
1．电泳仪（600V）及盘状电泳电泳槽
2．电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径5～7mm，长80～100mm 3．玻璃架（制胶时用来垂直插放玻璃管） 4．微量注射器或微量吸管 5．带长针头的注射器 6．日光灯
7．带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管 四、 试剂和材料 1．血清
2．贮液和工作溶液 按下表配制。 贮液和工作溶液的配制
凝胶储备液
A储备液：分离胶缓冲液pH8.9 Tris~HCl缓冲液 B储备液：浓缩胶缓冲液 pH6.7 Tris~HCl缓冲液 C储备液：分离胶储备液 D储备液：浓缩胶储备液： Ｅ储备液：4% Ap（W/V） Ｆ储备液：40%蔗糖 G储备液：核黄素
3.电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸 4.染色液：考马斯亮蓝溶液
精选
5.脱色剂：7%冰乙酸
五、操作一般先制分离胶，再在分离胶上面制作浓缩胶。
（一）凝胶的制备
1．制胶板/凝胶玻璃管的准备 2．分离胶的制备 3．浓缩胶的制备 4. 制胶/装柱 分离胶配置
凝胶浓度（%） 7.2 双蒸水（ml） 2 Ａ储备液（ml） 2 Ｃ储备液（ml） 4 Ｅ储备液（ ml ） 8 总体积（ml） 16 浓缩胶配制
胶液浓度（%） 3.1 Ｂ储备液（ml） 0.5 Ｄ储备液（ml） 1 G储备液（ ml ） 0.5 Ｆ储备液（ml） 2 总体积 （ml） 4 (二)加样 (三)电泳 (四)剥胶
(五)固定和染色 (六)漂洗 六、注意事项
1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。
2．丙稀酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内（4℃）保存。可贮存1～2个月。测定pH（4.9～5.2）可检查其是否失效，失效不能聚合。 3．TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。
4．凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚合速度减慢，必须根据实验时的温度调整3号、4号试剂的用量，以使凝胶在30 min内聚合。 实验思考
1、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。
2、样品为什么会在浓缩胶内被压缩成狭窄的一条带？ 3、为什么聚丙烯酰胺凝胶电泳有较高的分辨率？ 4、为什么在分离胶和浓缩胶内使用不同的催化剂？
盘状电泳凝胶的制备：1．分离胶的制备 将贮液由冰箱取出，待达到室温后再按上表中的比例配制工作溶液。先将分离胶液与过硫酸铵溶液分别放在真空干燥器中。待抽出溶解
精选
的空气后取出，赶快混匀，用带长针的注射器吸取一定量的胶液，沿着管壁加到预先准备好的玻璃管中（玻璃管的一端用带有玻璃珠或小段玻璃棒的乳胶管塞住，在乳胶管中加2滴40%蔗糖后插在玻璃架上），灌入的分离胶液高约6.5cm，然后立即用带弯针头的小注射器在已加入的分离胶液面上，距胶面约0.1cm处沿管壁缓缓加入3～5mm高的蒸馏水层，切忌使加入之水呈滴状坠入胶液，这样会使顶部凝胶液度变稀，改变凝胶孔径。水层放好后，静置胶液使进行聚合反应。正常情况下10分钟开始聚合，应控制在30分钟至1小时内完成聚合。刚加水时看出有界面，后逐渐消失。等到再看出界面时，表明凝胶已经聚合，再静置30分钟使聚合完成。
2. 浓缩胶的制备 用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液（滤纸不要接触胶面）。按比例混匀浓缩胶液（也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，抽完气后再混合），先用这种胶液很快漂洗一下分离胶的顶部，除去漂洗液后，按上法加入浓缩胶液约0.5～1cm高，并立即仔细加水层。然后在距管口10cm处用日光灯照射进行光聚合。正常情况下照射6-7分钟就可看到浓缩胶液显乳白色，表明聚合开始。继续照半小时，使聚合完全。除去水层，吸干后用上电极槽缓冲液洗涤，再将这种缓冲液加至管顶，在室温放置0.5～1小时就可使用。浓缩胶应在临用前再制备。
3．加样 盘状电泳所需样品很少，用1mg/mL浓度的样品液每管需5～100μL。加样前先把玻璃管下边的橡胶塞除去要注意先拉开乳胶管使空气进入，再拔下来，防止将凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把管固定在上槽的洞中，要保证凝胶管垂直和橡皮塞孔密封不漏。管的下端悬上一滴缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。管中凝胶表面上部及上槽均灌满电极缓冲液。将4号贮液1份，水3份，20%蔗糖溶液4份混合，然后取血清3μL，加上述混合液0.15mL，混匀后小心地加在浓缩胶与电极缓冲液界面处，因样品液比重大，即平铺在凝胶表面。指示染料一般用溴酚蓝与酚红，通常每管加0.1%的染料溶液0.005mL，指示染料与样品混合后加入。
4．电泳 加完样后接通电源，负极在上，正极在下。调节电流，开始时用1―2mA/管，电泳1―2分钟，再升高电流到约3―5mA/管，不要一开始电流很高。电流最好不超过5mA，以免产热过多，必要时应进行冷却或在冷库内进行。当指示染料迁移到凝胶柱的下端附近时就可停止电泳，关闭电流，取出玻管。缓冲液可再行使用，但上下槽缓冲液不能混淆，因下槽缓冲液中已混入催化剂及氯离子（快离子），如将它当作上槽液就要影响电泳效果。 5．凝胶的取出 将一针头长约10 cm的注射器吸滴水。将针头插入凝胶与管壁之间，并紧贴管壁，一面注入水一面慢慢旋转玻管并推针前进，靠水流压力和润滑作用使玻管内壁与凝胶分开，待水从玻管一端流出时，再慢慢将针头退出。然后去掉针头，用注射器向玻管中快速注射水，将凝胶压出玻管。如凝胶浓度较高，取出困难，可用10%的甘油水溶液代替水注入。一般剥胶方向是从浓缩胶端开始。
6．固定 为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需进行固定。方法是把剥出的凝胶柱浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟或浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸液配制的染色液中，同时进行固定和染色。 7．染色 染色的操作过程见下表。 蛋白质的染色法 方法 氨基黑 固定 甲醇 染液 用0.1mol/L氢氧化钠配制的1%氨基黑 染色时间 5min(室温) 脱色 乙醇 精选
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