RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解,从水解液中可用定糖,定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。 试剂和器材 一、试剂
0.04M NaOH溶液;95%乙醇;1.5M硫酸;浓氨水;0.1M硝酸银。 酸性乙醇溶液:30mL乙醇加0.3mL HCl。
三氯化铁浓盐溶液:将2mL 10%三氯化铁(FeCl3· 6H2O)溶液加入400mL浓HCl。 苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液:称取6g苔黑酚溶于95%乙醇100mL。 定磷试剂:
17%硫酸:将17mL浓硫酸(比重1084)缓缓倾入83mL水中; 2.5%鉬酸铵:2.5g鉬酸铵溶于100mL水中;
10%抗坏血酸溶液:10g抗坏血酸溶于100mL 水,棕色并保存溶液; 临用时将三种溶液和水按下列比例混合:
17%硫酸:2.5%鉬酸铵:10%抗坏血酸:水=1:1:1:2(V/V)。 二、材料 干酵母粉。 三、器材
移液管0.2mL(×1),2.0mL(×1), 1mL(×4); 量筒10 mL(×1), 50mL(×1); 滴管;水浴锅;离心机。 操作方法
一、酵母RNA提取
称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶,沸水浴加热30min,冷却,转入离心管。3000转/分,离心15分钟后,将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇,边加边搅动。加毕,静置,待RNA沉淀完全后,3000r/min离心3min。弃去上清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后,用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤,沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量,计算:
二、RNA组份鉴定
取2g提取的核酸,加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液,然后进行组份鉴定。
1.嘌呤碱:取水解液1mL 加入过量浓氨水。然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。
2.核糖:取水解液1mL,三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。
3.磷酸:取水解液1mL,加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。 思考题
1.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解? 2.如何从酵母中提取到较纯的RNA?
精选
实验七、 底物浓度对酶促反应速度的影响
——米氏常数的测定
一、目的
1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响。 2.学习测定米氏常数(Km)的原理和方法。 二、原理
早在1913年,Michaelis和Menten首先提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式。即米氏方程式:
式中:
v为反应初速度; V为最大反应速度; [S]为底物浓度;
Km为米氏常数,其单位为摩尔浓度。
Km值是酶的一个特征性常数,一般说来,Km可以近似地表示酶与底物的亲和力。测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。
Lineweaver-Burk作图法是用实验方法测定Km值的最常用的比较方便的方法。
Lineweaver和Burk将米氏方程改写成倒数形式:
精选
本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例,采用Lineweaver- Burk双倒数作图法测定Km值。
胰蛋白酶是胰液中的一个酶,它催化蛋白质中碱性氨基酸(L-精氨酸和L-赖氨酸)的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基,因此可以用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。 三、器材
1.50 mL及150 mL锥形瓶
2.25 mL碱滴定管、滴定台、蝴蝶夹 3.10 mL及5 mL吸管 4.100 mL量筒 5.恒温水浴 四、试剂和材料
1.40 g/L酪蛋白溶液(pH8.5) 10 000 mL
40 g酪蛋白溶解在大约900 mL水中,再加20 mL1mol/L NaOH,连续振荡此悬浮液,微热直至溶解,最后用1mol/LHCl或1mol/L NaOH调到pH8.5,并用水稀释至1L。
2.胰蛋白酶溶液(40 g/L) 2000 mL
可用由胰脏制备的粗胰蛋白酶制剂配制,并放入冰箱内保存。
五、操作
精选
分别向6个小锥形瓶中加入5 mL甲醛溶液和1滴酚酞,并滴加0.1mol/L标准氢氧化钠溶液,直至混合物呈微粉红色。所有锥形瓶中的颜色应当一致。
取100mL酪蛋白溶液,加入另一锥形瓶中,在 37℃水 浴中保温10分钟。将胰蛋白酶液也在37℃水浴中保温10 分钟。然后精确地量取10 mL酶液加到酪蛋白溶液中(同时 记时)。充分混合后,随即取出 10 mL反应混合物(作为零时 的样品)吹至一含甲醛的锥形瓶中。向所取的反应混合物中 加入酚酞(每mL混合物加入1滴酚酞),用0.1mol/LNaOH滴定直至呈微弱但持续的粉红色,在接近到达终点之前,再加入指示剂(每mL氢氧化钠溶液加入1滴酚酞)。然后,继续滴至终点,记下所用0.1mol/L氢氧化钠溶液的mL数。
在2、4、6、8和10分钟时,分别取出10mL消化样品,准确地照上法操作。在每个样品中滴定终点的颜色应当是一致的。用增加的滴定度对时间作图,测定初速度。
配制不同浓度的酪蛋白溶液(7.5、10、15、20、30 g/L)测定不同底物浓度时的活力。
思考题
1.如何正确测定酶促反应速度?
2.用实验所得的反应速度数据,对相应的底物浓度作图。由所得 曲线可以看出底物浓度对酶反应的影响有何特殊规律?
实验八、胰凝乳蛋白酶的提取制备及活力测定
一 实验目的和要求
1.学习和掌握胰凝乳蛋白酶的提取原理和方法
2学习对粗提的胰凝乳蛋白酶进行初步纯化的方法和活力测定的方法 二 实验原理
(1) 胰凝乳蛋白酶是以无活力的酶原存在于动物的胰脏中,酶原可以被肠激酶 钙离子活化或自我活化成为有活力的酶.,制备结晶的胰蛋白酶的基本方法是用硫酸铵分级盐析的方法, 比活力是指单位重量的蛋白质样品中所含酶活力的单位数。
本实验从猪胰脏中提取、分离、纯化胰凝乳蛋白酶。采用酶活力单位数/mg蛋白质样品表示酶的比活力。用福林酚试剂法测定样品中的蛋白质含量。把在PH7.4,温度25摄氏度时,保温10分钟能使底物酪蛋白水解出10-4mmol酪氨酸的胰凝乳蛋白酶规定为1个单位。酪氨酸与酚试剂作用产生蓝色,其深浅与酪氨酸量成正比,故用胰凝乳蛋白酶催化酪蛋白水解
精选
所得产物酪氨酸的多少来判定样品中胰凝乳蛋白酶的活力单位数。 三 实验器材和药品
高速组织搅碎机, 组织匀浆机 离心机 分光光度计 水浴锅 透析袋 大烧杯 抽滤泵 抽滤瓶 硫酸 乙酸 硫酸铵 胰蛋白酶 酪蛋白溶液 磷酸盐缓冲液 碱性铜溶液 酚试剂
四 实验方法
1. 猪胰凝乳蛋白酶的提纯
(1)取新鲜猪胰脏,放在盛有冰冷0.125mol/L硫酸的溶液中,保存在冰箱中备用。剥去脂肪和结缔组织后称重。剪碎后装入组织捣碎机内,悬浮于2倍体积的冰冷0.5mol/L硫酸溶液中,方在冰箱中过夜。将上述混悬液离心10分钟,上层液经过2层纱布过滤至烧杯中,将沉淀再混悬于等体积0.125mol/L硫酸溶液中,再离心,将2次上层液合并,即为提取液。留样测定蛋白质和酶活力。
(2)分离 使用不同饱和度的硫酸铵溶液分别盐析分离蛋白质,用透析法出去盐离子。 (3)结晶 取分离所得的胰凝乳蛋白酶溶于3倍体积水中,取0.5ml留样测定蛋白质和酶活力。然后加硫酸氨(1.14g/10ml0至胰凝乳蛋白酶溶液达0.25饱和度,用0.1mol/L氢氧化钠调节pH至6.0,在室温(25摄氏度)放置12小时即可出现结晶。 2、胰凝乳蛋白酶比活力的测定 (1)样品蛋白质含量的测定
A蛋白质标准曲线的制备 准确取一定量的人血清活牛血清清蛋白,用凯式定氮法测定蛋白质含量。
另准确取10mg的血清蛋白,用蒸馏水溶解,定容到10ml。再继续按下法配制蛋白质稀释液。
提取液10ml
加固体硫酸氨1.14g,达0.2饱和度, 放置10分钟,离心(3000r/min)10分钟 弃去沉淀 保留上层液
取7ml,加固体硫酸氨1.323g,达0.5饱和度, 放置10分钟,离心(3000r/min)10分钟 弃去上层液 保留沉淀
溶解于3倍体积的水中,装入半透膜透析
袋,对pH5.0,0.01mol/L醋酸缓冲液透析
两天(用1%氯化钡检查已无白色沉淀产
生),离心5分钟(3000r/min)10分钟 。
弃去沉淀 保留清夜 (变性的酶蛋白) 加固体硫酸氨3.9g/10ml),达 0.6饱和度,放置10分钟,离心10
精选
完整版生物化学实验电子教案.02.22.doc
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