RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。 试剂和器材 一、试剂
0.04M NaOH溶液；95%乙醇；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银。 酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。
三氯化铁浓盐溶液：将2mL 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL浓HCl。 苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。 定磷试剂：
17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中； 2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；
10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液； 临用时将三种溶液和水按下列比例混合：
17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。 二、材料 干酵母粉。 三、器材
移液管0.2mL（×1）,2.0mL（×1）, 1mL（×4）; 量筒10 mL（×1）, 50mL（×1）; 滴管；水浴锅；离心机。 操作方法
一、酵母RNA提取
称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：
二、RNA组份鉴定
取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。
1．嘌呤碱：取水解液1mL 加入过量浓氨水。然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。
2．核糖：取水解液1mL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。
3．磷酸：取水解液1mL，加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。 思考题
1．为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ 2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?
精选
实验七、 底物浓度对酶促反应速度的影响
——米氏常数的测定
一、目的
1．了解底物浓度对酶促反应速度的影响。 2．学习测定米氏常数（Km）的原理和方法。 二、原理
早在1913年，Michaelis和Menten首先提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式。即米氏方程式：
式中：
v为反应初速度； V为最大反应速度； [S]为底物浓度；
Km为米氏常数，其单位为摩尔浓度。
Km值是酶的一个特征性常数，一般说来，Km可以近似地表示酶与底物的亲和力。测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。
Lineweaver-Burk作图法是用实验方法测定Km值的最常用的比较方便的方法。
Lineweaver和Burk将米氏方程改写成倒数形式：
精选
本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver- Burk双倒数作图法测定Km值。
胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。 三、器材
1．50 mL及150 mL锥形瓶
2．25 mL碱滴定管、滴定台、蝴蝶夹 3．10 mL及5 mL吸管 4．100 mL量筒 5．恒温水浴 四、试剂和材料
1．40 g／L酪蛋白溶液（pH8.5） 10 000 mL
40 g酪蛋白溶解在大约900 mL水中，再加20 mL1mol／L NaOH，连续振荡此悬浮液，微热直至溶解，最后用1mol／LHCl或1mol／L NaOH调到pH8.5，并用水稀释至1L。
2．胰蛋白酶溶液（40 g／L） 2000 mL
可用由胰脏制备的粗胰蛋白酶制剂配制，并放入冰箱内保存。
五、操作
精选
分别向6个小锥形瓶中加入5 mL甲醛溶液和1滴酚酞，并滴加0.1mol／L标准氢氧化钠溶液，直至混合物呈微粉红色。所有锥形瓶中的颜色应当一致。
取100mL酪蛋白溶液，加入另一锥形瓶中，在 37℃水 浴中保温10分钟。将胰蛋白酶液也在37℃水浴中保温10 分钟。然后精确地量取10 mL酶液加到酪蛋白溶液中（同时 记时）。充分混合后，随即取出 10 mL反应混合物（作为零时 的样品）吹至一含甲醛的锥形瓶中。向所取的反应混合物中 加入酚酞（每mL混合物加入1滴酚酞），用0.1mol／LNaOH滴定直至呈微弱但持续的粉红色，在接近到达终点之前，再加入指示剂（每mL氢氧化钠溶液加入1滴酚酞）。然后，继续滴至终点，记下所用0.1mol／L氢氧化钠溶液的mL数。
在2、4、6、8和10分钟时，分别取出10mL消化样品，准确地照上法操作。在每个样品中滴定终点的颜色应当是一致的。用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。
配制不同浓度的酪蛋白溶液（7.5、10、15、20、30 g／L）测定不同底物浓度时的活力。
思考题
1．如何正确测定酶促反应速度？
2．用实验所得的反应速度数据，对相应的底物浓度作图。由所得 曲线可以看出底物浓度对酶反应的影响有何特殊规律？
实验八、胰凝乳蛋白酶的提取制备及活力测定
一 实验目的和要求
1.学习和掌握胰凝乳蛋白酶的提取原理和方法
2学习对粗提的胰凝乳蛋白酶进行初步纯化的方法和活力测定的方法 二 实验原理
(1) 胰凝乳蛋白酶是以无活力的酶原存在于动物的胰脏中,酶原可以被肠激酶 钙离子活化或自我活化成为有活力的酶.,制备结晶的胰蛋白酶的基本方法是用硫酸铵分级盐析的方法, 比活力是指单位重量的蛋白质样品中所含酶活力的单位数。
本实验从猪胰脏中提取、分离、纯化胰凝乳蛋白酶。采用酶活力单位数/mg蛋白质样品表示酶的比活力。用福林酚试剂法测定样品中的蛋白质含量。把在PH7.4，温度25摄氏度时，保温10分钟能使底物酪蛋白水解出10－4mmol酪氨酸的胰凝乳蛋白酶规定为1个单位。酪氨酸与酚试剂作用产生蓝色，其深浅与酪氨酸量成正比，故用胰凝乳蛋白酶催化酪蛋白水解
精选
所得产物酪氨酸的多少来判定样品中胰凝乳蛋白酶的活力单位数。 三 实验器材和药品
高速组织搅碎机, 组织匀浆机 离心机 分光光度计 水浴锅 透析袋 大烧杯 抽滤泵 抽滤瓶 硫酸 乙酸 硫酸铵 胰蛋白酶 酪蛋白溶液 磷酸盐缓冲液 碱性铜溶液 酚试剂
四 实验方法
1. 猪胰凝乳蛋白酶的提纯
（1）取新鲜猪胰脏，放在盛有冰冷0.125mol/L硫酸的溶液中，保存在冰箱中备用。剥去脂肪和结缔组织后称重。剪碎后装入组织捣碎机内，悬浮于2倍体积的冰冷0.5mol/L硫酸溶液中，方在冰箱中过夜。将上述混悬液离心10分钟，上层液经过2层纱布过滤至烧杯中，将沉淀再混悬于等体积0.125mol/L硫酸溶液中，再离心，将2次上层液合并，即为提取液。留样测定蛋白质和酶活力。
（2）分离 使用不同饱和度的硫酸铵溶液分别盐析分离蛋白质，用透析法出去盐离子。 （3）结晶 取分离所得的胰凝乳蛋白酶溶于3倍体积水中，取0.5ml留样测定蛋白质和酶活力。然后加硫酸氨（1.14g/10ml0至胰凝乳蛋白酶溶液达0.25饱和度，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH至6.0，在室温（25摄氏度）放置12小时即可出现结晶。 2、胰凝乳蛋白酶比活力的测定 （1）样品蛋白质含量的测定
A蛋白质标准曲线的制备 准确取一定量的人血清活牛血清清蛋白，用凯式定氮法测定蛋白质含量。
另准确取10mg的血清蛋白，用蒸馏水溶解，定容到10ml。再继续按下法配制蛋白质稀释液。
提取液10ml
加固体硫酸氨1.14g，达0.2饱和度， 放置10分钟，离心（3000r/min）10分钟 弃去沉淀 保留上层液
取7ml，加固体硫酸氨1.323g，达0.5饱和度， 放置10分钟，离心（3000r/min）10分钟 弃去上层液 保留沉淀
溶解于3倍体积的水中，装入半透膜透析
袋，对pH5.0，0.01mol/L醋酸缓冲液透析
两天（用1％氯化钡检查已无白色沉淀产
生）,离心5分钟（3000r/min）10分钟 。
弃去沉淀 保留清夜 （变性的酶蛋白） 加固体硫酸氨3.9g/10ml)，达 0.6饱和度，放置10分钟，离心10
精选
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