完整版生物化学实验电子教案.02.22.doc

反应式为: 2NH4++OH-==NH3+H2O

NH3+H3BO3==NH4++H2BO3-

3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然

后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。 三 实验试剂

HCI标准溶液（0.01 mol.L-1 ） H3BO3溶液(2%) H2SO4(浓)

NaOH溶液(30%) K2SO4(固体)

CuSO4.5H2O(固体)

甲基红—溴甲酚绿混合指示剂

四 实验仪器:

凯氏烧瓶（100ml）:1个 50ml容量瓶 凯氏定氮装置 烘箱 移液管(10ml): 1支 酸式滴定管(10ml): 1支 分析天平 电炉

五 实验步骤

一、 消化液的制取

准确称取干燥样品0.5g，置于凯氏烧瓶内，加入0.2g(K2SO4,CuSO4.5H2O)混合物及15ml浓H2SO4，加数粒玻璃珠，缓慢加热，当硫酸分解开始放出二氧化硫白烟后，即加大火力至溶液澄清，再继续加热约1h，冷却至室温。沿瓶壁加入50ml纯水，溶解盐类，冷却，转入100ml容量瓶中，以纯水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。 二、NH3的固定

1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中加数滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石 在整个蒸馏过程中需保持此液为橙红色，否则补加H2SO4。接收液为20ml 2%的H3BO4溶液，其中加2滴混合指示剂，接收时使装置的冷凝管下口浸入吸收液的液面之下先用蒸汽洗涤整个装置,约15分钟,用含指示剂的硼酸溶液检测装置是否洗干净。如果不变色才说明洗净了.

2、蒸馏:移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用少量水冲洗进样口，然后加入10ml 30% NaOH溶液于反应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开始回流记时，自变色起再蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏，用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸收液内。 三、NH3的标定

用0.01mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。 四）计算

（A(?B)?0.0100?14样(克氮%)??100 品的总氮含量C?1000

若测定的样品含氮量部分只是蛋白性，（如血清）则：

(A?B)?0.0100?14?6.25?100样品的总蛋白含量（克蛋白%）=

C?1000精选

式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。

若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更复杂一

些。首先需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后的样品的上清液中的含氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质的含量。

蛋白氮=总氮—非蛋白氮

蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.25

2、 考马斯亮蓝染色法

1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一.

考马斯亮蓝G-20染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合.

? 在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质浓度成正比.

实验四、 酪蛋白的制备

一、目的

1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。

二、原理

牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

三、材料、试剂与器具 （一）材料 新鲜牛奶 （一）试剂

1、95%乙醇 1 200mL 2、无水乙醚 1 200mL 3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液 300ml 先配A液与B液

A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。

B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。 4、乙醇——乙醚混合液

乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）

（二）器具

1、离心机 2、抽滤装置

精选

3、精密pH试纸或酸度计 4、 电炉 5、烧杯 6、温度计

四、操作步骤

（一）酪蛋白的粗提

100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化

1、用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。

2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

3、将沉淀摊开在表面 上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。

含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）

式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。

五、注意事项

1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。

2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。

3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。

六、实验报告

1、根据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。 2、合理分析实验所得率

七、思考题

1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？

实验五、 植物基因组DNA提取及含量测定

1、 DNA的提取

一 目的要求

1.学习植物DNA分离的原理

2.掌握植物基因组DNA提取的方法及含量的测定方法 二 实验原理

利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞.细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来.EDTA抑制DNA酶的活性.再用酚﹑氯仿抽提的方法去去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀.得到的DNA溶解进行定量测定：利用紫外分光光度法或定磷法进行测定。

教学内容1.材料的选择

2.介绍细胞破碎的不同方法 3.DNA的提取

精选

4.DNA定量测定

三 实验材料 仪器和药品

低温离心机 ,恒温水浴锅, 台式离心机 ,琼脂糖凝胶电泳系统 Tris ,EDTA , NaCl, β巯基乙醇,等

1. 细胞提取液:

100mmol/L Tris.HCL pH8.0 5mmol/L EDTA pH8.0 500mmol/L NaCl

1.25% SDS

1mol/L β巯基乙醇 5mol/L KCl

四 实验步骤

1.取4g新鲜叶片,在液氮中研磨成粉末状.

2.转移至50ml离心管中,加入16ml细胞提取液,充分混匀.65℃水浴 保温20min.

3.从水浴中取出离心管,加入5ml 5mol/L KCL溶液,混匀,水浴20min. 4.4000r/min离心20min.

5.将上清液转移到另一50ml离心管中.

6.加等体积酚/氯仿混匀,12000r/min 离心5min, 取上清. 7.加等体积氯仿,混匀,12000r/min 离心5min, 取上清. 8.加入0.6~1倍体积的异丙醇,混匀.

9.离心获得沉淀,70%乙醇洗3次.风干沉淀. 10.加入500ul TE缓冲液,溶解DNA. 11.进行定量测定.

2、 DNA的定量测定：二苯胺法

一、目的和要求

1、学习和了解核酸的定量测定的常用方法。 2、掌握用二苯胺法测定DNA 的操作方法。 二、原理

核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。本实验采用针对DNA的二苯胺法测DNA的含量。在酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在595nm有最大吸收，在40～400ug/mL范围内其峰值与DNA含量成正比。 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω–羟基–γ–酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595）。在DNA浓度为20～200μg/ml范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。

1. 标准曲线的制作

取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓

度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

试1234精选

管 标准DNA/ml 蒸馏水/ml 二苯胺试剂/ml .6 .4 0.8 1.2 40.2 1.8 41.6 0.4 41.0 0460℃恒温水浴中保温1h，冷却，在595nm波长处比色 光密度值

2. 样品的测定

取待测样品2ml，加入二苯胺溶液4ml，摇匀，60℃保温1h，然后

在595nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的DNA的ug数，按下式计算待测样品的DNA的含量。

待测样品中测得的DNA的ug数

DNA%＝

X 100

待测样品液中样品的ug数 3、 DNA的定量测定：紫外分光光度法

原理: 利用DNA在260nm有最大的吸收峰的特性进行测定

1. 制标准曲线

2 测定所提取的DNA的含量

实验六、 酵母RNA的提取及组份鉴定

目的要求

（1）了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。 （2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 实验原理

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。 酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

精选