生物化学实验电子教案
欢迎同学们学习生物化学实验
第一部分 生物化学实验基本要求及技术
一、生物化学实验室规则
1. 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。 2. 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字简练、准确，要求同学们记录完整准确的实验数据，养成良好的实事求是的工作作风和求真务实的科学态度，严禁伪造实验数据，弄虚作假。完成实验后经教员检查同意，方可离开实验室，课后写出实验报告，于下次实验前上交。
3. 实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐，公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器须洗净放好，将实验台面抹试干净，才能离开实验室。
4. 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心细致，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员，不得擅自动手检修。
5. 实验室内严禁吸烟！煤气灯应随用随关，严格做到：人在火在，人走火灭。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即关好煤气开关和水笼头，拉下电闸。离开实验室以前应认真、负责地进行检查，严防发生安全事故。 6. 所有实验用的废液，废弃物等，都要收集在适当的容器内，加以储存再处理，不能倒在水槽内或到处乱扔。
7. 仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。
8. 实验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。 9. 每次实验课由班长负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作及填写《实验情况登记卡》和《实验记录》。
二、实验报告要求及格式
实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。 实验报告用统一的实验报告纸写，在第一行写明姓名，学号，组别及班级。
按照实验内容可分为定性和定量实验两大类，下面简单介绍实验报告的格式。
（实验名称） 姓名 学号 日期
目的和要求 原理
试剂配制及仪器 操作方法 实验结果 讨论与分析
通常每次实验课只做一个定量实验，在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应
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简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂配制及仪器）和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始实验数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括：关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象以及思考题，进行探讨；对于实验设计的认识、体会和建议；对实验课的改进意见等。
三、生物化学技术的研究手段、方法、内容
? 手段：包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、各种层析设备、各种电泳装
置、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、摇床等等。 ? 方法：透析技术、电泳技术、层析技术、 离心技术、分光光度计技术、免疫化学技术
? 内容：糖类、脂类、核酸、蛋白质的分子结构、提取、分离、纯化及其定性、定量
鉴定、分析研究。
? 手段：包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、各种层析设备、各种电泳装
置、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、摇床等等。 ? 方法：透析技术、电泳技术、层析技术、 离心技术、分光光度计技术、免疫化学技术
? 内容：糖类、脂类、核酸、蛋白质的分子结构、提取、分离、纯化及其定性、定量
鉴定、分析研究。
（一 ）紫外-可见分光光度分析法
基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。 分为:光谱分析法和非光谱分析法。
光谱分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。
（二） 层析法 （chromatography）
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
?
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。
?
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气
体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性
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使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。
（三） 电泳技术
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电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 ?
电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Re?ss进行了世界上第一
次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。
电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类：
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自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 ?
区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型 ?
按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：
①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。
②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。
? 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分
离物的电荷多少进行分离。
淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。
⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。
a.聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质
b.另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。 c. 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。
（四） 生物大分子的制备
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。
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与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 ②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。
③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 ④生物材料的破碎和预处理。
⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。
第二部分 实验室操作实验
实验二 粗脂肪的提取和定量测定─索氏提取法
一、目的和要求
1. 学习和掌握粗脂肪的定量测定法─索氏提取法。 2. 学习和掌握用重量分析法对粗脂肪进行定量测定。
3 将理论能用于实践当中:比较不同材料中所含粗脂肪的含量。 二、原理
脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物, 能溶于脂溶性有机溶剂。本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30oC -60 oC的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。 四、仪器设备及试剂
1、脱脂棉 2、镊子 3、分析天平 4、电热恒温水浴锅 5、恒温烘箱 6、索氏脂肪提取器 7、索氏脂肪提取仪 8、滤纸 9、干燥器 10 无水乙醚
五、步骤
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1.抽提瓶在105℃±2℃烘箱中烘至恒重，材料干燥至恒重。
2.称取干燥后的材料1-2g,放入研钵中研磨(越细越好)将研磨好的材料用脱脂滤纸包住,用少许脱脂棉擦拭研钵壁上粘的材料及油脂,也一并放入滤纸包. 用棉线拴住滤纸包,将滤纸包放入抽提管，在抽提瓶中加入2/3体积的无水乙醚在70-75℃的水浴上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为每小时约10次，共回流约50次，或检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。 3 取出试样，仍用原提取器回收乙醚直至抽提瓶全部吸完，擦净瓶外壁，将抽提瓶放入105℃±2℃烘箱中烘干至恒重。 六.计算
W1—W0
粗脂肪%=———— ×100
W
式中：W——样品重（g） W0——提取瓶重（g）
W1——提取瓶和脂肪重（g）
七、注意事项
1．向滤纸筒内填装样品及回流提取过程中都不应外漏，否则重做。 2．应用无水乙醚，并在通风柜中进行蒸干，实验室内禁止明火与吸烟。 3．提取瓶中加入的乙醚不能少于1/2,也不能多余2/3。
实验三、蛋白质的含量测定
目前常用的有四种古老的经典方法:凯式定氮法，,双缩脲法( Biuret法) ， Folin -酚试剂法( Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法( Bradford法).其中Bradford 法和 Lowry 法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比 Biuret 法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质
1、 凯氏定氮法
一 实验目的和要求
(1)掌握利用凯式定氮法测定生物材料中氮的含量和蛋白质的含量的方法 (2)理论用于实践中:比较不同的材料中蛋白质的含量 二 原理
样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液 被中和的程度可计算得样品氮的含量.以甘氨酸为例:
1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4 反应式为： H2SO4==SO2+H2O+[O]
R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3 NH3
R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O 2NH3+H2SO4==(NH4)2SO4
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。
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完整版生物化学实验电子教案.02.22.doc
