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不同pH条件下五倍子中没食子酸、单宁酸、β—PGG含量测定及分析
作者：周国丽 郑仕萍 杨晓红郭雪 范源 来源：《云南中医中药杂志》2014年第12期
摘要：目的 研究及分析在不同的pH溶液中，五倍子中没食子酸、单宁酸、五没食子酰基葡萄糖（β-PGG）的含量变化。方法 将五倍子粉末分别加入pH为4，4.5，5，5.5，6醋酸盐缓冲液中，在95℃水浴条件下提取3.5 h，用反相高效液相色谱测定没食子酸、单宁酸、β-PGG的含量。结果 当pH等于4时，五倍子醋酸盐缓冲液的没食子酸含量最高；pH等于4.5时，单宁酸的含量最高；pH等于5.5时，β-PGG的含量最高。结论 在pH分别等于4、4.5、5.5的条件下，五倍子醋酸盐缓冲液中的没食子酸、单宁酸、β-PGG的含量最高。 关键词：五倍子；醋酸盐缓冲液；β-PGG；没食子酸；单宁酸；HPLC；不同pH 中图分类号：P284 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2014）12-0059-03
五倍子是我国传统中药，《本草纲目》记载五倍子性酸、咸、平、无毒，能敛肺降火，化痰饮，止咳嗽、止渴等[1]。临床研究表明五倍子具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒以及收敛等药理作用。五倍子含有丰富的鞣质成分，如β-PGG、没食子酸、单宁酸等，通常这些活性成分的提取方法有溶剂提取法[2-5]、水解法[6]等。为了研究五倍子提取的新实验方法，通过用不同pH醋酸缓冲液，结合溶剂提取法提取五倍子中的β-PGG、没食子酸、单宁酸，测定并分析其含量变化。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂 干燥五倍子。乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），磷酸（分析纯），醋酸（分析纯），醋酸钠，均购自云南丹赤贸易有限公司，纯净水。β-PGG标准品（购自成都普瑞法科技开发有限公司，批号：14021908）、没食子酸（购自云南昆明中检所，批号：110831-201204）、单宁酸标准品（成都迈斯克医药科技有限公司，批号：130721）。
1.2 仪器 DFY-600摇摆式高速万能粉碎机，D2KW-D电热恒温水浴锅，Agilent1200型高效液相色谱仪（VWD检测器），分析天平，酸度计（OHAUS/奥豪斯，型号 STARTER 3100/F）。 1.3 方法
1.3.1 没食子酸、单宁酸、β-PGG对照品溶液的制备 精密称定没食子酸对照品0.25 mg，置10 mL容量瓶中，加入50%甲醇制成25 mg/mL的溶液，备用。精密称取0.30 mg单宁酸对照
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品，用乙醇、水、丙酮体积比为69.9%、29.8%、0.3%的溶液溶解并定容，制备成浓度为30 ug/mL的单宁酸标准溶液，备用。精密称定β-PGG对照品0.25 mg，置10 mL容量瓶中，加入甲醇制成25 ug/mL的溶液，备用。
1.3.2 β-PGG、没食子酸、单宁酸供试品溶液的制备 干燥五倍子粉碎，过80目筛，备用。精密称取5份五倍子粉末各约0.2 g分别置于250 mL带塞锥形瓶中，分别精密加入醋酸盐缓冲液40 mL，95℃水浴锅中加热水解3.5 h，冷却，过滤。精密量取续滤液1.5 mL于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，均摇，即得供试品溶液。 1.3.3 没食子酸含量测定方法
1.3.3.1 没食子酸色谱条件 色谱柱 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；以甲醇-0.2%磷酸溶液（5∶ 95）为流动相；检测波长为273 nm；柱温：25℃。
1.3.3.2 没食子酸线性关系考察 精密称取对照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，摇匀作为储备液。分别精密吸取0.1、0.5、1、2、4 mL于10 mL容量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即配制成浓度为1、5、10、20、40 ug/mL的标准溶液。按上述色谱条件进样20 uL，以没食子酸的峰面积（Y）对标准品的浓度（X）进线性回归，得方程y=114.7x+2.4554，r=0.9999，结果表明：没食子酸峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为1-10 ug/mL。 1.3.4 单宁酸含量测定方法
1.3.4.1 单宁酸色谱条件 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；以甲醇-水（80∶ 20）为流动相；检测波长为275 nm；柱温：25℃。
1.3.4.2 单宁酸线性关系考察 精密称取对照品2.58 ug，置于10 mL容量瓶中，用乙醇、水、丙酮体积比为69.9、29.8、0.3%的溶液溶解并定容至刻度，摇匀作为储备液。按上述单宁酸色谱条件分别取2、4、6、8、10 uL不同体积进样，以单宁酸的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，得方程y=5719.5x-1924.8，r=0.9974，结果表明：单宁酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0.516-2.58ug。 1.3.5 β-PGG含量测定方法
1.3.5.1 β-PGG色谱条件 色谱柱 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；流动相：0 min：乙腈-0.1%磷酸（10∶ 90），15 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75），15.1 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75），20 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75）；检测波长为281 nm；柱温：25℃。 1.3.5.2 β-PGG线性关系考察 精密称取对照品8 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，作为储备液。从中精密吸取10 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述β-PGG色谱条件分别取2、4、6、8、10、15 uL不同体积进样，以β-PGG
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的峰面积（Y）对标准品的质量（X）进行线性回归，得方程y=2420237x-18.445，r=0.9998，结果表明：β-PGG峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0.139-1.0428ug。 2 结果与分析 2.1 实验数据 见表1。
2.2 结果分析 用pH=4；4.5；5；5.5；6的醋酸缓冲液提取五倍子中的没食子酸，含量最高的是pH为4的缓冲液，见图1。单宁酸含量最高的是pH为4.5的缓冲液，见图2。β-PGG含量最高的是pH等于5.5的缓冲液，见图3。而pH为6时，五倍子中没食子酸、β-PGG、单宁酸的含量均最低。
五倍子单宁酸是一种易水解的多酚化合物，其能在酸性、碱性条件下水解产生没食子酸、β-PGG等中间产物，这些中间产物之间存在相互转化的可能，导致在不同的pH条件下，单宁酸、没食子酸、β-PGG的含量均呈现相应的变化。 3 结论
五倍子单宁酸的提取方法主要有溶剂提取法、超声辅助提取法[7-10]、微波提取法[11-12]、加压提取法[13]、超临界CO2 萃取法[14]。没食子酸的制备方法有酸水解法（常用硫酸）、碱水解法、发酵法、酶法。β-PGG的制备主要是醇解法[15-16]。本实验运用HPLC法测定五倍子醋酸缓冲液在不同pH（4；4.5；5；5.5；6）条件下，其单宁酸、没食子酸、β-PGG的含量变化，结果显示pH等于4时，没食子酸的含量最多。pH为5.5时，β-PGG的含量最多。pH为4.5时，单宁酸含量最高。而pH为6时，五倍子中没食子酸、单宁酸、β-PGG的含量均最低，以上结果可能是没食子酸、单宁酸、β-PGG在不同pH条件下稳定性及水解机制不同所致。
本实验运用醋酸缓冲液提取五倍子中的有效成分，得出了提取没食子酸、单宁酸、β-PGG的较适pH值，可为研究五倍子的制药工艺、质量控制及五倍子开发利用提供一定参考。 参考文献：
[1]吴力克.五倍子的药理研究及临床研究[J].中药医学刊，2001。19（1）：88-89. [2]吕翔，杨子祥.角倍单宁酸和没食子酸含量的比较及影响因子分析[J].林业科学研究，2010，23（6）：856-861.
[3]李红然，付大友.五倍子中有效成分提取方法研究进展[J].工广东化工，2010，37（10）：71，79.
[4]柳世萍，李毅.五倍子提取单宁酸的工艺研究[J].河北化工，2007，30（10）：44-45.
不同pH条件下五倍子中没食子酸、单宁酸、β—PGG含量测定及分析
