产纤维素酶地衣芽孢杆菌B.LY02摇瓶发酵条件优化
余祖华a，丁 轲a，b，侯 奎b，李元晓b，李 旺b
【摘 要】摘要：为了提高产纤维素酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis LY02，B.LY02)的产酶能力，采用单因素试验对该菌株产酶的摇瓶发酵条件进行了优化。优化结果显示：菌株B.LY02发酵培养基的最适碳源为麦芽糖，氮源为酵母膏，初始pH值为5.0，培养温度为37 ℃，培养时间为30 h，装液量为60 mL(250 mL三角瓶)，接种量(体积分数)为2%，摇床转速180～200 r/min 。通过优化发酵条件，菌株B.LY02的产酶活性达到了0.683 5 U/mL，比优化前提高了约27.73%。
【期刊名称】河南科技大学学报（自然科学版） 【年(卷),期】2016(037)004 【总页数】5
【关键词】纤维素酶；地衣芽孢杆菌；发酵条件；酶活
0 引言
纤维素是地球上最丰富的可再生资源之一[1]，但由于其较难降解，所以尚未得到充分利用。学者们一直在探寻降解纤维素的有效方法，比如酸、碱和蒸汽加热等，但这些方法存在降解产物回收率低和二次污染等问题，限制了其应用[2]。目前，利用产纤维素酶的微生物来降解秸秆成为一种更接近自然的纤维素降解方法[3]。地衣芽孢杆菌是目前应用较多的益生菌之一，它自身能合成蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶等消化性酶类[4-7]。因此，利用产纤维素酶的地衣芽孢杆菌对秸秆进行生物降解是处理和利用秸秆最具前景的方法。但自然存在的纤维素酶产率往往较低[8]，对纤维素的降解能力有限。近年来的研究发现：
从自然界中筛选产纤维素酶的菌株后，对其发酵条件进行优化以及对菌株进行诱变或改造，可提高菌株产纤维素酶的能力。文献[9]利用紫外线对出发菌株进行诱变后，获得的绿色木霉菌(Trichoderma vride)菌株K6产纤维素酶的酶活性是出发菌株的1.39倍。文献[10]从书虱伴生菌中筛选得到5株产纤维素酶的菌株，分别使用单因素分析法和响应面分析法，对纤维素酶活性最高的S2菌株的产酶发酵条件进行了优化，在优化后的发酵条件下，S2菌株的纤维素酶活力比优化前提高了45%。
文献[11]从土壤中分离得到了一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis LY02，B.LY02)，但其在新鲜培养液中的产酶活性最高仅为0.535 1 U/mL。为了提高B.LY02的产酶活性，本文对菌株B.LY02进行了发酵条件的优化，以摸索最佳产酶发酵条件，为其进一步的工业化应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
地衣芽孢杆菌B.LY02由河南科技大学宏翔生物饲料实验室分离保存。
种子培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。
发酵培养基：牛肉膏5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，羧甲基纤维素钠10.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。
发酵产酶培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，羧甲基纤维素钠10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。
3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)试剂：称取200.0 g酒石酸
钾钠，溶于一定量水中，加热溶解，添加3,5-二硝基水杨酸10.0 g，氢氧化钠10.0 g，溶解后加入苯酚2.0 g，无水亚硫酸钠0.5 g。全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1 000 mL。用前一周配制。 1.2 方法
1.2.1 培养基碳源的优化
在发酵产酶培养基中用不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖和淀粉)，质量浓度为10 g/L，按2.0%(体积分数)接种种子液，37 ℃、转速180 r/min振荡培养24 h，离心取上清液。采用3,5-二硝基水杨酸法[5,12]测定上清液中的纤维素酶酶活(下同)，确定培养基的最佳碳源。 1.2.2 培养基氮源的优化
在最佳碳源的基础上，培养基中用不同的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和硝酸钾)，质量浓度均为10 g/L，按2.0%(体积分数)接种种子液，37 ℃、转速180 r/min振荡培养24 h，离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定培养基的最佳氮源。 1.2.3 接种量的优化
将种子液按体积分数分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%接种于100 mL优化的产酶培养基，于37 ℃、转速180 r/min振荡培养24 h，离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最佳接种量。 1.2.4 摇床转速的优化
取10个250 mL三角瓶，各加入50 mL优化的产酶培养基，按1.2.3筛选的最佳接种量接种，分别于120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min和260 r/min的转速下，37 ℃振荡培养
24 h。离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最佳摇床转速。 1.2.5 培养基装液量的优化
取10个250 mL三角瓶，分别加入20 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL和100 mL优化的产酶培养基，按1.2.3筛选的最佳接种量接种，于37 ℃、转速180 r/min振荡培养24 h。离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最佳装液量。 1.2.6 培养温度的优化
采用上述最佳条件，将菌液分别于25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃和46 ℃条件下培养24 h，每瓶取样5 mL,离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最适培养温度。 1.2.7 培养时间的优化
采用上述最佳条件，将菌液分别培养12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h，每瓶取样5 mL,离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最适培养时间。
1.2.8 培养基初始pH值的优化
取6个200 mL三角瓶，采用上述最佳条件进行配制，将各瓶培养基 pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，按照上述最佳条件培养，离心取上清，测定纤维素酶酶活，确定最佳初始pH值。 1.2.9 优化前后酶活对比
采用最佳培养基及最佳发酵条件对B.LY02菌株进行发酵培养，测定纤维素酶酶活，同时以优化前发酵条件为对照，对比优化后和优化前菌株纤维素酶酶活的变化。
2 结果与分析
2.1 培养基碳源对酶活的影响
在发酵产酶培养基的基础上，研究不同碳源对B.LY02菌株产纤维素酶酶活的影响，结果见表1。由表1可以看出：当以麦芽糖为碳源时酶活最高，而以葡萄糖为碳源时酶活最低。 2.2 培养基氮源对酶活的影响
在发酵产酶培养基的基础上，研究不同氮源对B.LY02菌株产纤维素酶酶活的影响，结果见表2。由表2可以看出：该菌株对有机氮源的利用显著优于无机氮源，其中，以酵母膏为氮源时菌株的酶活最高，其次是蛋白胨和牛肉膏。 2.3 接种量对酶活的影响
不同接种量对菌株产纤维素酶酶活的影响结果见表3。由表3可以看出：在接种量为0.5%～2.0%时，菌株产酶活性基本与接种量呈正相关，随着接种量的增加而增加；接种量为2.0%时酶活最高，然后随着接种量的增加，酶活呈逐渐下降趋势。
2.4 摇床转速对酶活的影响
摇床转速对产纤维素酶酶活的影响结果见表4。由表4可知：转速在180～200 r/min时酶活最高；但当转速超过200 r/min时，酶活呈下降趋势。 2.5 培养基装液量对酶活的影响
培养基装液量对产纤维素酶酶活的影响结果见表5。由表5可知：装液量在20～60 mL时，随着装液量的增加，菌株酶活也在增加；在装液量为60 mL时，菌株酶活最大，但超过60 mL后，酶活呈下降趋势。 2.6 培养温度对酶活的影响
产纤维素酶地衣芽孢杆菌 B.LY02摇瓶发酵条件优化
