流动相的调节是搞液相分析最重要的环节

流动相的调节是搞液相分析最重要的环节，也是液相水平高低的度量，每一种液相都有影响它的主要因素，抓住主要因素，问题就容易解决。欢迎大家讨论。一则可以为新手传播知识，二则大家相互学习共同提高！

先开个头：常用的是化学键合相色谱，分离中性化合较简单，主要是调节溶剂强度，可从有机相的比例合种类两个方面入手，例如：有机相占的比例大，出峰就早。分离酸碱化合物就就复杂一点，增加了添加剂，明白了添加剂的作用，然后从溶剂，酸碱性，添加剂等方面入手。问题就容易解决。 液相色谱采用键合硅胶可以分离绝大多数的分析物质，针对不同化学性质的单体采用不同的键合硅胶，现在有什么十八烷 、氨基柱、氰基、苯基太多了，再加上不同流动相也就是加入不同的抑制剂可以测许多成分，比如：酸性的可以用十八烷加入酸，加缓冲盐；碱性物质可以加缓冲盐，以个人来讲用离子对的形式较多，并且效果也很好，现在分析生物碱是比较难做的，

如用反相色谱柱时，一般先改变有机相与水相的比例；再考虑改变pH值，酸性物质将pH值调低，碱性物质将pH值调高；如两者都无效，可考虑加入离子对试剂，如庚烷磺酸钠用于（碱性药物）

一. 反相HPLC中的溶剂优化：1.首先应调整k’值：强溶剂→20％递减→选择

合适的溶液强度，使得k’在1～20（tR：3～35min）。 一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k’。当所有谱峰符合1＜k’＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度)。（反相色谱——溶剂极性弱洗脱能力强，组分k’减小）。另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k’值符合1＜k’＜20范围的大概溶剂成分。2.改变选择性(á)：根据分子间作用力将溶剂分组。不同组的溶剂选择性不同，根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性。

二. 离子对HPLC中的溶剂优化: 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术。关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。

① 基本原理：有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+，B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。由于离子对具有疏水性，因而被非极性固定相(即有机相)提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。以上这类色谱法称反相离子对色谱法。能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多种官能团化合物的分离。可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。 反相离子对色谱中流动相的影响小结 ：1.改变选择性：a.改变溶剂种类: 改变溶剂选择性的方法，类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。b.改变pH: 组分离子与平衡离子的生成，离子对的形成，都与流动相的pH值密切相关。改变流动相的pH可以改变体系的选择性。流动相的pH值应调节到能使不同组分有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求，只有

使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH范围内保持完全离解，因此，只有强酸盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐)和强碱盐(季铵盐)才满足此要求。c.系统选择:使用一种有机溶剂(甲醇)；流动相的其它三种成分为pH=2.5(和pH=7.5

的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度(例如：200mM)

的离子对试剂的缓冲液(D)。以组合不一的缓冲液(B—D)进行七次实验，并变化甲醇(A)量以保持每次实验的k’值范围大致恒定。 三.正相HPLC中的溶剂优化 ①溶剂

非极性溶剂：正己烷或FC-113（1,1,2-三氟-1,1,2-三氯乙烷） 极性溶剂：非定位、碱性定位和非碱性定位 按正相HPLC中谱峰间距效应分类的溶剂

取代和定位是正相HPLC流动相选择性的主要来源 ②溶剂强度调节 ③选择性影响 四、梯度洗脱

梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使，已成为高效液相色谱法不可缺少的部分。所谓梯度洗脱，就是有两种(或两种以上)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。

梯度期间，强溶剂B(如反相HPLC中的甲醇)的浓度增大。在下述讨论中，我们将这种溶剂的浓度写作 B％ 。

梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。梯度洗脱对于复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。因为这些样品的k’范围宽，不能用等度方法简单地处置。 １．梯度洗脱期间的平均k’值 tR=tm(1+k’)

VR=Vm(1+k’)=Vm+kVs

针对做生物碱的朋友：

1. 用常规的ODS柱会出现一个最普遍的问题是：峰很宽，拖尾很严重！ 原因：ODS柱有很多未键合的硅羟基，与N缔合造成。

解决方案：使用BDS柱，他是用碱钝化残余的硅羟基，很好的避免了拖尾现象！

2. 用常规的SCX离子交换柱会出现一个普遍的问题是：重现性差，随流动相的pH值大小，Rt变化大！ 原因：所谓离子交换柱，就是阴阳正负离子的交换，由于流动相的离子浓度的变化，势必会影响交换平衡！ 解决方案：流动相用Buffer缓冲液！

实际上用冰醋酸、三氟乙酸、柠檬酸的也不少！

酸的作用就是根据pKa调节pH值，一定程度上抑制样品组分的解离

反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。

对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形

式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用磷酸(或乙酸、三氯乙酸、1%的甲酸、硫酸、50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液）作用可以抑制溶质的离子化,获对称的色谱峰；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和或30mmol/L三乙胺溶液。

（注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。）

高效液相色谱法（HPLC）复核细则 3．建立方法时，应考虑下列事项：

②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH值应为3~4。

你是可以通过多种办法测定流动相和样品溶液的pH值。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。 分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱）基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照下图：

一般的钾盐溶解度要比钠盐的。高的缓冲盐浓度有较高的缓冲容量，但是在有机相多的情况下容易析出，高溶解度的钾盐要比钠盐有优势。但是钾盐要贵一点。

磷酸二氢铵嘛就是2个缓冲盐放一起了。缓冲能力、范围更好了，不过铵不稳定。这种体系的流动相不易长时间放置。最好一天一换。