图片简介:
本技术介绍了一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，该方法步骤如下：1）接种用主要器具准备；2）烟苗培育；3）接种用细菌液的准备；4）离体叶片的采集；5）离体叶片的处置；6）接种病菌；7）接种后处置。本技术的优点是：1.本技术所用器具简单，接种发病过程时间短，占用空间场地少，方法简易便捷，无需高难度的技术操作，工作效率高；2.本技术利用较小的烟叶，烟苗的培育准备快速易行；发病症状与田间症状一致，清晰易识别，重现性好，接种发病局部条件容易控制，容易实现技术方法的标准化。
技术要求
1.一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，其特征在于，在倾斜的培养
皿内将烟草离体叶片接种烟草青枯病菌，导致叶片的叶脉组织坏死而表现出清 晰的发病症状；
人工发病方法的步骤如下：
1）接种用主要器具准备：用普通培养皿作接种用主要器具，清洁消毒后
备用；
2）烟苗培育：按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，直至烟苗叶片长度
与步骤1）的培养皿直径相近时，即可使用；
3）接种用细菌液的准备：将烟草青枯病菌移植到NA一般细菌培养基平板
上，NA培养基的成分：牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克， 水1000ml，30℃培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落 洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水调配成细菌浓度为
2.5×108cfu/ml，作接种用细菌液；
4）离体叶片的采集：用干净剪刀，剪取步骤2）烟草植株上的叶片长度
与步骤1）的培养皿直径相近的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻 轻冲洗干净叶片表面后待用；
5）离体叶片的处置：将步骤1）备好的培养皿倾斜放置，打开皿盖，取
步骤4）准备的离体叶片展开放入培养皿内，叶片的顶端置于倾斜培养皿的高 处，叶片的基端置于培养皿的最低处，并用一段干净灭菌的短玻璃棒将叶片的 基端压住，每培养皿放一片叶片；
6）接种病菌：取步骤3）准备的接种用细菌液注入步骤5）的放有离体叶
片的培养皿内，使细菌液浸没叶片基部，盖回培养皿盖；
7）接种后处置：将步骤6）的带有叶片和细菌液的培养皿置于具备正常散射
光的普通室内培养，培养温度维持在28～30℃；
接种结果导致叶片出现非常清楚的叶脉坏死以及脉间组织的坏死症状，一 般接种后2天开始表现症状，4～6天后整个叶片全部坏死。 说明书
一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法技术领域
本技术涉及农业技术和生物技术。具体是一种烟草青枯病离体接种的人工 发病方法。 背景技术
在植物病害控防研究中，许多基础问题的研究或重要理论问题的研究均离 不开人工接种发病这基本手段。植物病害人工发病可以在活体植株上接种，也 可在植物离体器官材料上接种。采用活体植株接种发病的研究结果，虽然更能 反映寄主-病菌互作的本貌，但在活体上接种，往往需要较多的时间和空间场 地，耗费较多的精力和财力，而且在许多情况下，局部条件控制的难度较大； 而采用植物离体器官材料接种发病，往往需要较少的时间和空间需求，简单易 行，接种发病的局部条件较容易控制，容易提高试验的规模与效率；许多植物 病理学问题，采用离体材料接种手段进行研究，也能达到研究目的，或者说， 采用在离体材料上接种与在活体植株上接种的研究结果是一致的。因此，在稻 瘟病、稻纹枯病、小麦赤霉病、小麦白粉病、大豆锈病、马铃薯晚疫病、葡萄 霜霉病、以及瓜类疫病、瓜类霜霉病、多种作物炭疽病等许多重要植物病害研 究中，均有采用离体接种方法进行有关研究。
烟草青枯病全球普遍发生，是烟草生产的毁灭性病害，该病害的病原菌 （Ralstonia solanacearum）也是当前国际上研究植物病原细菌致病机制的模 式系统之一。在烟草青枯病的有关研究中，也有许多采用离体叶接种人工发病 的应用案例，但长期以来，烟草青枯病离体叶人工发病，主要采用如下的技术 方法。
用注射器将青枯病菌菌液通过细小的针头注入叶片组织内，或者通过无针 头方式将菌液压渗入叶片组织内，并以接种点附近组织的色泽变化为主要依 据，判别接种发病的结果。虽然该接种方法体系很有效，但也存在一些明显的 弊病：1）操作技术难度大，要将细菌液准确地压渗入或者注入到厚度与针头 直径几乎等同的较薄的叶片组织内，不但需要训练有素的操作者，操作的效率 也较为低下；2）接种结果主要表现为在接种点附近组织的局部坏死，与该病 害的系统侵染症状有一定的差距。在高节奏的当代工作中，往往要求应用的技 术方法工作起来简易便捷，并能高效率、高通量和高准确性，上述的弊病显然 使得当前的烟草离体接种方法难以适应要求。
烟草青枯病的主要症状表现为萎蔫，同时还可以引起输导系统及其附近组 织的坏死，叶片的输导组织分布在叶脉上，输导系统及其附近组织的坏死，可 导致叶脉外观上呈褐色至黑色的坏死，这种症状特征应在人工接种发病中加以 利用，但至今未见有将这种清晰的症状表现，在人工发病实践中的应用及其 配套技术。 技术内容
本技术的目的是提供一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法。 本技术解决上述技术问题的技术方案如下：
一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，主要内容是在倾斜的培养皿内 将烟草离体叶片接种烟草青枯病菌，导致叶片的叶脉组织坏死而表现出清晰的 发病症状，人工发病方法的步骤如下：
1.接种用主要器具准备：用普通培养皿作接种用主要器具，清洁消毒后
备用；
2.烟苗培育：按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，直至烟苗叶片长度
与步骤1的培养皿直径相近时，即可使用；
3.接种用细菌液的准备：将烟草青枯病菌移植到NA等一般细菌培养基平
板上，NA培养基的成分：牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10 克，水1000ml，30℃培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌 菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水将细菌量调配 成108cfu/ml的浓度级别，作为接种用细菌液。
4.离体叶片的采集：用干净剪刀，剪取步骤2烟草植株上的叶片长度与
步骤1的培养皿直径相近的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲 洗干净叶片表面后待用。
5.离体叶片的处置：将步骤1备好的培养皿倾斜放置，打开皿盖，取步
骤4准备的离体叶片展开放入培养皿内，叶片的顶端置于倾斜培养皿的高处， 叶片的基端置于培养皿的最低处，并用一段干净灭菌的短玻璃棒将叶片的基端 压住，每培养皿放一片叶片。
6.接种病菌：取步骤3准备的接种细菌液注入步骤5的放有离体叶片的
培养皿内，使细菌液浸没叶片基部，盖回培养皿盖。
7.接种后处置：将步骤6的带有叶片和细菌液的培养皿置于具备正常散
射光的普通室内培养，培养温度维持在28～30℃。
接种结果导致叶片出现非常清楚的叶脉坏死以及脉间组织的坏死症状，一 般接种后2天开始表现症状，4～6天后整个叶片全部坏死。 本技术的优点是：
1）利用较小的烟叶，烟苗的培育准备快速易行。
2）所用器具简单，接种发病过程时间短，占用空间场地少。 3）发病症状与田间症状一致，清晰易识别，重现性好。 3）方法简易便捷，无需高难度的技术操作，工作效率高。 5）接种发病局部条件容易控制，容易实现技术方法的标准化。
附图说明
图1是本技术接种用的培养皿处于倾斜状态。 图2是本技术的离体叶片的放置方式及接种后的状态。
图3是本技术接种发病初期症状，图中A、B、C、D、E是接种病菌的叶 脉坏死表现，F是接种清水空白对照的表现。
烟草青枯病离体接种的人工发病方法与相关技术
