马缨杜鹃不同完整性居群遗传多样性的AFLP分析
纵 丹 a，员 涛 a，李佳蔓 a，周安佩 a，胡世俊 b，何承忠 a,b，
【摘 要】采用选择性扩增片段多态性（AFLP）技术对马缨杜鹃5个不同完整性居群的遗传多样性进行检测和分析。结果表明：筛选出的7对引物组合共扩增出527条带，其中多态带382条，多态带百分率为72.49%；5个居群间的多态性百分率在52.23%～69.64%之间，居群平均多态性百分率为57.80%；Nei’s基因多样性变化范围在0.113 9～0.173 8之间，Shannon信息指数为0.186 8～0.277 7；居群间遗传分化系数Gst为0.168 8，表明83.12%遗传变异发生在居群内，居群间基因流为2.462 4，足以维持居群间现有的遗传结构；AMOVA分析结果表明，18.34%的遗传变异存在于居群间，81.66%的遗传变异存在于居群内；基于UPGMA聚类结果，可将5个马缨杜鹃居群分为3组，紫溪山和板凳山居群、马雄山和小营地居群之间各为一组，老湾地居群独自一组。研究表明，该物种有些居群虽遭受严重的人为破坏，但居群的遗传多样性仍然较高。
【期刊名称】中南林业科技大学学报 【年(卷),期】2014(000)009 【总页数】6
【关键词】马缨杜鹃；居群；AFLP标记；遗传多样性
马缨杜鹃Rhododendron delavayi Franch又名马缨花，是杜鹃花科常绿杜鹃亚属植物，直立小乔木或灌木，高3～8 m，最高可达到12 m以上，喜酸性土壤[1-2]，主要分布于云南、贵州等较高海拔的地区，有耐寒、耐旱、花色鲜艳、花期长等特性，可药用，具有较高的观赏和药用价值[3-4]。目前国外对杜鹃花
的宏观和微观研究相对较多，在分子水平主要是对同种不同环境的居群的分析[5]、耐寒基因研究[6]、转基因研究[7]和分子遗传图谱的构建[8]等。国内对杜鹃属植物的研究主要包括两个方面，一是对杜鹃属植物分类学的基础性研究，另一方面是与应用有关的组培育种驯化和生理生化研究[9]，如对马缨杜鹃种子的萌发以及播种苗的生长规律[2,10]、马缨杜鹃种子萌发生长的最佳生理条件[4]、不同浸种方式对4个居群的马缨杜鹃种子发芽率影响和组织培养与快速繁殖的研究[11-12]等。
近年来，随着人类活动的加剧，物种赖以生存的生态环境受到严重的破坏，而生境的破坏和片段化又以更微妙的方式影响物种的生存，不仅对生物性和物理性的生态系统造成干扰[13]，也严重影响物种的遗传结构[14-15]。因此，生境破坏后的物种群体遗传多样性已成为当前研究的热点。张文标等[16]采用RAPD技术对不同生境夏腊梅的群体遗传多样性进行了分析；胡世俊等[17]分析了生境破碎对缙云卫矛种群遗传多样性的影响。当前，马缨杜鹃被广泛应用于园林绿化之中，但所用苗木基本来自于采挖野生资源，对马缨杜鹃种群结构造成了极大的破坏。而采用分子标记技术开展马缨杜鹃的相关研究报道较少，仅有赵喜华等[18]采用RAPD技术探讨了9种常绿杜鹃亚属和2种马缨花亚属杜鹃的种间亲缘关系及系统位置。
AFLP作为RAPD和RFLP相结合的一种分子标记技术，不仅具有RAPD的随机性和方便性，而且具有RFLP的专一性和可靠性[19]。本研究采用AFLP分子标记技术，对分布于云南境内5个马缨杜鹃不同完整性居群的遗传多样性进行检测，旨在了解这些不同破坏程度的马缨杜鹃自然居群的遗传变异及遗传结构特征，并探讨在当前较严重的生境干扰情况下，该物种的遗传多样性如何变化，
为更好地保护其遗传多样性提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料分别采集于云南省楚雄市紫溪山、板凳山和曲靖市马雄山、小营地、老湾地5个马缨杜鹃的自然分布居群。每个居群确定5 km×5 km大小的取样范围，按照随机取样的原则，从中心点开始向四个方向每隔250 m采集1份，将采集的叶片用硅胶干燥，带回实验室备用。每居群的样本数及居群生境与结构完整性概况见表1。 1.2 方 法
1.2.1 基因组DNA提取
将133份样本的叶片磨碎后，使用改良的SDS法依照标准酚/氯仿流程提取总DNA[20]。提取后的总DNA采用0.8%的琼脂糖进行电泳检测，-20℃保存，备用。
1.2.2 AFLP分析
AFLP分析的基本过程参照Vos等[21]的方法进行。采用EcoRⅠ+MesⅠ限制性内切酶组合进行基因组DNA的双酶切，预扩增反应采用EcoRⅠ+00/MesⅠ+00的引物组合，选择性扩增反应采用引物组合EcoRⅠ+3/MesⅠ+3，PCR扩增反应在PTC-100TM Thermal PCR仪上进行。 1.2.3 选择性扩增产物的电泳分离
选择性扩增产物加入1/3体积的双指示剂短暂离心后，95 ℃变性5 min，取出后立即放入碎冰中，取样6 μL于已预电泳30 min的6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，其功率恒定为70 W，时间约2 h，电泳产物采用银染法[22]
马缨杜鹃不同完整性居群遗传多样性的AFLP分析
