基于纳米技术的病原微生物核酸快速检测研究进展

基于纳米技术的病原微生物核酸快速检测研究进展*

李庆梅a，张亮亮a，张洪a，罗阳a,b

【摘 要】摘要：病原微生物感染危害严重，基于核酸的早期快速检测是其防控关键。近年来，纳米材料因其特殊的光、电、热、磁等性质，被广泛应用于病原微生物核酸的快速、灵敏检测。该文结合纳米材料在核酸快速检测中的纳米尺寸效应，总结了近年来纳米技术在病原微生物核酸检测中的应用，旨在为病原微生物感染的有效防控提供帮助。 【期刊名称】临床检验杂志 【年(卷),期】2019(037)007 【总页数】4

【关键词】纳米技术；核酸；微生物感染 ·专家论坛·

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81572079,81871733)；重庆大学中央高校基本科研业务费专项项目(2018CDGFSG0017);重庆市技术创新与应用示范(社会民生类)项目(CSCT2018JSCX-MSYBXO146)。

近年来，由病原微生物引起的感染性疾病频发，对公共健康的威胁日益严重。据世界卫生统计报告显示，每年有超1 000万人死于感染性疾病，约占疾病总死亡人数的30%。对病原微生物进行早期快速检测是感染性疾病防控的关键。传统病原微生物检测主要采用细菌培养、生化鉴定等技术。这些技术具有操作简单、结果准确等优点，但其所需时间较长，对操作人员及环境要求高，易出现“窗口期”而导致假阴性结果。在应对突发性疾病感染时，难以满足快速、实时、准确检测等需求。核酸是病原微生物体内重要的遗传物质，在生长、遗

传和变异等一系列重大生命现象中起着决定性的作用，通过检测核酸可以快速地诊断出所感染的病原微生物类型。研究发现，纳米材料具有特殊的光、电、热、磁等效应，与现有的核酸检测技术结合后，可提升现有技术的检测灵敏度和特异性，简化操作流程,提高检测速度。近年来，纳米孔测序、基于纳米材料的等温扩增、纳米生物传感器等技术的出现，为病原微生物的核酸检测提供了实时、准确的技术方案。本文对纳米技术在病原微生物核酸早期检测中的应用进行了总结，并分析了纳米材料在其中所发挥的纳米效应。

1 基于纳米孔的单分子测序技术

纳米孔是由生物或聚合物材料制成的纳米级孔，其纳米尺寸效应在测序中发挥了重要的作用。测序是核酸检测中最直观、准确的方法之一。随着科技的不断发展，测序技术已经从第一代的Sanger测序法发展到以纳米孔测序为主的第三代测序技术。

相较于利用光信号的单分子实时测序技术，纳米孔技术是利用核酸分子通过纳米孔时产生的电信号变化实现测序的，是一种新兴的无标记、无扩增技术，具有通量高、速度快、成本低、检测序列长等优点，尤其适用于现场检测[1]。Quick等[2]使用纳米孔对埃博拉病毒进行DNA检测，仅需60 min即可完成序列测定，该检测方法具有便携、快速等优点，可在有限的条件下实现对病毒的实时监测，还可用于沙门菌和溶血性巴氏杆菌等微生物的检测[3-4]。尽管生物纳米孔技术具有通量高、速度快等优势，但其稳定性和持久性较差，从而限制了该类技术的发展。与生物纳米孔相比，固态纳米孔在稳定性上具有明显的优势。基于氮化硅、氮化硼、二硫化钼、石墨烯等纳米材料制备出的固态纳米孔具有更好的稳定性，且可有效降低背景信号对检测结果的影响。Choi等[5]

制备的氮化硅纳米孔在保证检测准确性的同时，可将背景信号值由原来的146.7 PA降至5.4 PA。Wasfi等[6]制备的石墨烯基固态纳米孔提高了测序过程的准确性。其原因在于，石墨烯的厚度(约0.3 nm)与2个碱基之间的距离相近，可有效降低DNA分子通过纳米孔时的速度，从而确保了检测的准确性。 快速发展的纳米孔测序技术为微生物感染的早期诊断、治疗和预防提供了可靠策略，但在通道的选择性、控制DNA穿孔速度及提高信噪比等方面仍需进一步研究[7]。

2 基于纳米材料的核酸扩增检测技术

基于核酸扩增的分子诊断技术，已被广泛应用于病原微生物的快速检测。等温扩增技术尤其适合现场快速检测，但传统的等温扩增技术存在着结果判读复杂、难以实现多重检测等问题。纳米材料具有优异的光学性质，其溶液颜色随粒径大小的变化而变化，如金纳米颗粒(AuNPs)随粒径的减小，溶液颜色逐渐从蓝灰色变化为橙色,在检测领域具有较好的应用前景。将传统核酸检测技术与纳米材料进行结合，可有效改善其检测性能。

2.1 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) LAMP技术是一种特异性强、灵敏度高、快速简便的核酸扩增技术[8]。其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利用聚合酶在等温条件下扩增靶序列，实现信号放大，但该技术存在结果判读难的问题。为了解决上述问题，Manajit等[9]将AuNPs与LAMP结合，实现对铜绿假单胞菌的高效检测。本研究中，AuNPs与靶DNA互补杂交，能够抑制AuNPs因静电作用而在盐溶液中发生聚集的现象，从而提高DNA-AuNP的稳定性，使溶液仍呈红色(若聚集,溶液由红色变为蓝色或者透明)，便于结果的判读。