2021探讨二化螟基因组及功能基因与分子生物学领域的研究范文2

2021探讨二化螟基因组及功能基因与分

子生物学领域的研究范文

　　摘要：简要介绍近年来二化螟生理生化与分子生物学领域的研究进展,综述二化螟基因组及功能基因、抗药性、对Bt抗性的分子机制、神经受体、嗅觉相关基因、

miRNA、热休克蛋白, 以及被寄生蜂调控等相关研究, 旨在为二化螟的绿色防控提供理论参考。 　　二化螟(Chilo suppressalis) 在亚洲、北非和南欧是最重要的水稻害虫之一。二化螟幼虫在水稻叶鞘和茎秆内钻蛀为害, 形成枯心、白穗及虫伤株等[1]。在中国, 二化螟每年都能造成严重的生产损失, 化学防治目前依然是主要的防治手段, 但是二化螟已对多种农药产生抗性[2]。二化螟基因组测序、转录组测序和小RNA测序的不断完成, 为研究二化螟生理生化特性和基因功能提供了坚实的基础。CRISPR/Cas9技术在二化螟中已得到成功应用[3], 将为今后二化螟基因功能的解析、开辟二化螟新型防控技术提供坚实的技术支撑。为此, 本文就近年来有关二化螟基因组及功能基因、抗药性、对Bt抗性的分子机制、神经受体、嗅觉相关基因、热休克蛋白, 以及被寄生蜂调控等相关研究的最新进展进行概述。 　　1二化螟基因组及功能基因 　　随着组学及相关技术的迅速发展,二化螟基因组及功能基因组研究也得以发展。在完成二化螟基因组测序的基础上, 二化螟基因组数据库ChiloDB已构建。该数据库收录了二化螟的基因组、转录组和小RNA数据, 为二化螟研究提供了开放的数据平台

[4,5]。另外, 二化螟的中肠、脂肪体、血细胞、触角、信息素分泌腺和神经系统等不同组织的转录组测序[6,7,8,9,10,11]也为二化螟功能基因研究提供了基础。基于基因组和转录组数据, 二化螟的类胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[12]、类丝氨酸蛋白抑制剂[13]、类半胱氨酸蛋白酶[14]、P450[15]和几丁质酶[16,17]等基因家族被鉴定分析, 这些研究为深入解析各家族基因的功能奠定了很好的大数据基础。 　　2二化螟抗药性机理 　　使用杀虫剂仍是防治二化螟最重要的手段,持续使用单一杀虫剂会导致二化螟抗性的快速发展, 因此监测杀虫剂抗性将为二化螟的综合防治提供必要的信息。2010—2012年, 研究人员调查了我国7省55个二化螟田间种群对双酰胺类杀虫剂的敏感性, 发现大多数种群对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺仍处于敏感水平阶段, 只有少数种群对这2种双酰胺类杀虫剂表现出低到中等水平的抗性, 如浙江象山和浙江苍南二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺表现出低水平抗性, 湖北武穴种群对氯虫苯甲酰胺表现出中等水平抗性[18,19]。另有研究发现, 江苏仪征、湖南东安、浙江象山及江西上高等田间种群对氟苯虫酰胺表现出低水平抗性 (5.1~9.3倍) , 浙江金华种群对氟苯虫酰胺产生了11.8倍的中等水平抗性[20]。2015年, 在我国7省开展的19个二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗药性检测发现, 浙江象山种群对氯虫苯甲酰胺表现87.9倍的中等水平抗性, 浙江苍南和余姚种群分别表现135倍和141.1倍的高水平抗性, 这3个地区的种群对氟苯虫酰胺都表现为中等抗性 (15~58.7倍) [21], 说明上述地区的二化螟可能已经对双酰胺类杀虫剂产生了较高水平的抗性。可见加强抗药性监测及有关机理研究很有必要。 　　关于二化螟对新型药剂抗性的机理研究也取得了一定进展。鱼尼丁受体(RyR) 被认为是二酰胺类杀虫剂的作用靶标, 二化螟的RyR已成功地被克隆分析[22,23]。在对

氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗性分别达到77.6倍和42.6倍的二化螟种群中, Yao等[2]检测到RyR第4 946位的甘氨酸 (G) 突变为谷氨酸 (E) (G4946E) 。先前在小菜蛾上的研究表明, RyR的G4946E突变会导致药剂与受体的结合能力下降, 这是其对双酰胺类杀虫剂产生抗性的重要机制[24]。增效试验发现, 二化螟对双酰胺类杀虫剂的抗性与3种解毒酶[P450、谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 和酯酶 (EST) ]没有明显的相关性。然而, Lu等[25]发现, G4946E突变与二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性没有显著的相关性, 认为可能是EST在二化螟对氯虫苯甲酰胺产生抗性的过程中发挥作用。Sun等[26]在氯虫苯甲酰胺二化螟抗性种群中发现了RyR一个新的突变Y4667D, 而另一个保守的突变I4758M发生的频率达到94.4%。与敏感种群相比, 氯虫苯甲酰胺抗性种群中RyR的mRNA表达水平显著下降。使用氯虫苯甲酰胺处理之后, 所有种群的RyR表达水平均会下降到50%左右。增效评估和酶活试验显示, EST和P450可能参与了二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性。同时, Xu等[27]发现, P450基因CYP6CV5、CYP9A68、CYP321F3和CYP324A12在二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性种群中显著高表达, RNAi试验也证实这些P450基因参与了二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性。亚致死浓度的氯虫苯甲酰胺可以延缓二化螟的发育、降低其繁殖力, 卵黄蛋白 (Vg) 的表达水平也随之下降[28]。同时, 亚致死浓度的氯虫苯甲酰胺也可以诱导二化螟保幼激素 (JH) 合成基因 (JHAMT、FPPS1和FPPS2) 表达水平上升, 进而提高JH浓度[29]。 　　3二化螟Bt相关受体蛋白 　　二化螟是转Bt基因水稻的一个重要靶标害虫,其中, 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt) 的杀虫晶体蛋白Cry通过结合靶标昆虫中肠刷状缘膜囊泡 (BBMV) 上的特异受体发挥其杀虫活性。通过配体印迹和质谱方法, 在二化螟中肠中鉴定到了可能的Cry1Ab毒素受体蛋白氨肽酶 (APN) , 从二化螟中肠克隆得到APN不同基因型的全长, 通过RNAi干扰掉APN1、APN3a和APN5, 降低了二化螟幼虫取食转Cry1Ab水稻的死亡率[30]。同时, 另一篇研究显示, 干扰掉APN1和APN2, 取食转Cry1Ab和Cry1Ac融合基因的水稻TT51和转Cry1Ca基因的水稻T1C-19, 二化螟幼虫的死亡率显著降低[31]。钙黏蛋白 (CAD) 是一类钙离子依赖的细胞黏附蛋白, 被认为是Cry蛋白的受体之一[32]。通过喂食siRNA降低二化螟CAD1和CAD2的表达, 再取食转Cry2A和Cry1C的水稻, 幼虫的死亡率下降[33]。碱性磷酸酶 (ALPs) 在鳞翅目中被认为与Cry蛋白的毒性有关[34]。在二化螟中有6个ALP (ALP1~6) , 通过喂食双链RNA的方法干扰掉不同的ALP, 结果显示, 干扰掉ALP1、ALP2和ALP4能显著降低二化螟幼虫对转Cry1Ab/Cry1Ac水稻的敏感性, 干扰掉ALP1、ALP2、ALP3、ALP4和ALP6能降低二化螟对转Cry2Aa水稻的敏感性, 干扰掉ALP1、ALP2、ALP3、ALP4和ALP5显著增强二化螟对转Cry1Ca水稻的抗性[35]。研究表明, 活化蛋白激酶 (MAPK) p38的磷酸化能提高二化螟对Cry毒素的抗性[36], 在二化螟中干扰掉p38, 取食转Cry1Ca的水稻或掺入Cry1Ca蛋白的人工饲料, 幼虫的死亡率显著上升[37], 由此可见, MAPK p38能增强二化螟对Cry1Ca的抗性。 　　4二化螟神经受体 　　神经递质是化学突触传递中的信使,在突触前末梢通过不同的合成酶作用产生, 通过胞吐作用释放到突触间隙, 随后与位于突触后膜上的神经受体互作, 调控不同的生理与行为过程。通过对二化螟中枢神经系统进行转录组测序, 解析了二化螟的神经递质信号系统, 包括章鱼胺 (OA) 、酪胺 (TA) 、多巴胺 (DA) 、5-羟色胺、组胺、谷氨酸、乙酰胆碱和γ-氨基丁酸 (GABA) [9]。通过构建神经受体的真核表达载体, 将其在哺乳动物细胞系 (HEK-293) 中稳定表达, 解析了二化螟生物胺受体的药理学特性, 包括章鱼胺受体OA1[38]、OA2B2[39]和OA3[40], 酪胺受体TA1[41]和TA2[42], 多巴胺受体DOP1、DOP2和DOP3[43]。OA1和DOP2偶联Gs和Gq蛋白, 引起胞内cAMP和Ca2+浓

度上升[38,43];OA2B2和DOP1偶联Gs蛋白, 引起胞内cAMP浓度的上升[39,43];OA3、TA1和DOP3偶联Gi蛋白, 导致胞内c AMP浓度下降[40,41,43];TA2偶联Gq蛋白, 引起胞内Ca2+浓度上升[42]。生物胺不仅在神经调控中发挥重要作用, 而且参与免疫反应[44,45]。免疫荧光显示, 生物胺受体OA1、TA2和DOP1在二化螟的血细胞上有表达[38,42,46]。一系列研究发现, OA可能通过OA1受体调控血细胞的延展和吞噬[38], TA可能通过TA2受体调控血细胞的延展[42], 而DA可能通过DOP1受体调控血细胞的吞噬[46]。通过转录组测序, 在二化螟中鉴定到了12个烟碱型乙酰胆碱受体 (n AChRs) , 其中, α型9个、β型3个[47]。GABA受体是重要的农药靶标之一, 研究人员在二化螟中克隆和分析了GABA受体的2个亚型RDL1和RDL2, 将其在爪蟾卵母细胞 (Xenopus

oocytes) 中表达, 发现第2个跨膜区的2’位置的丝氨酸能影响RDL对地特灵的敏感性, 但不会影响对氟虫腈和氟雷拉纳的敏感性[48]。在昆虫中, 神经肽通过特异地结合其神经肽受体调控生理与行为过程, 研究人员在二化螟中鉴定到了43个神经肽基因和51个神经肽受体基因, 并借助定量PCR分析了这些基因在中枢神经系统、脂肪体、肠道和血细胞中的表达, 发现大部分均在神经系统显著高表达[49]。 　　5二化螟嗅觉相关基因 　　二化螟触角的转录组测序鉴定了嗅觉相关基因,包括47个气味受体 (ORs) 、20个离子通道型受体 (IRs) 、20个气味结合蛋白 (OBPs) 、4个信息素结合蛋白

(PBPs) 、2个一般气味结合蛋白 (GOBPs) 、21个化学感受蛋白 (CSPs) 和2个感觉神经元膜蛋白 (SNMPs) [8]。后来, 从二化螟的基因组数据中, 研究人员又鉴定出15个新的OBPs[50]。荧光竞争结合试验发现, OBP8对β-紫罗酮、橙花叔醇、法尼醇和2-已酮有很强的结合亲和力[50], GOBP1对法尼醇和油酸有很强的结合亲和力, 而GOBP2对雪松醇、法尼醇、月桂烯、β-紫罗酮和亚麻油酸有很好的结合亲和力[51]。通过在爪蟾卵母细胞 (Xenopus oocytes) 中表达, 发现PBP能增强信息素受体 (PRs) 对性信息素的敏感性[52]。借助CRISPR/Cas9技术, 研究人员成功构建了PBP1和PBP3的敲除突变体[3], 这也是在二化螟中首次通过CRISPR/Cas9实现基因突变。通过自交得到PBP1和PBP3的纯合突变体, 触角电位反应 (EAG) 试验显示, PBP1的纯合突变体对性信息素的电生理反应比PBP3降低得更多, 表明PBP1可能扮演着更加重要的作用[3]。 　　6二化螟miRNA 　　miRNA是一类小的、非编码的RNA,通过降解mRNA的转录或抑制翻译下调其靶标基因, 主要作用于其转录本的3’端[53]。通过小RNA测序, 在二化螟中鉴定到300个miRNA, 芯片分析表明, 在变态发育过程中有54个差异表达的miRNAs[54]。靶标预测和体外的双荧光素报告试验显示, 有7个miRNA (miR-9b、novel-260、Bantam、novel-154、novel-80、novel-89和novel-257) 协同调控蜕皮激素合成通路中的3个

Halloween基因 (Neverland, Disembodied和Spook) , 过表达这7个miRNA会降低20-羟基蜕皮激素 (20E) 的滴度, 导致二化螟死亡率上升和发育迟缓, 说明通过20E处理可以进行拯救[54]。通过人工miRNA表达技术, 将13个新型的二化螟内源miRNA在水稻中过表达, 喂食试验显示, 其中2个miRNA能够显著地抑制二化螟幼虫的生长, 当幼虫持续取食过表达miR-15的转基因水稻, 其化蛹时间推后了4 d[55]。另外, 在二化螟中鉴定到一个昆虫特有的miRNA (miR-14) , 预测其靶标基因为蜕皮激素信号网络中的2个关键基因Spook和蜕皮激素受体 (EcR) , 双荧光素报告试验表明, miR-14与Spook和EcR存在互作关系, miR-14在二化螟每个幼虫龄期的末段高表达, 且与2个靶标基因的表达负相关[56]。在5龄幼虫中注射miR-14的类似物, 会引起二化螟致死和畸形现象。将miR-14转到水稻中, 喂食试验显示, 表达miR-14的转基因水稻对二化螟有很高的抗