玉环县疾病预防控制中心作业指导书 标题：试剂配制 1 目的与适用范围
文件编号：YJKZ/ZYW6-001 版号：第 2 版，共 26 页 第 1 页 本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。
本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。 2 染色液配制及染色法
2.1 革兰氏染色法（可按成品试剂上的说明操作） 2.1.1 结晶紫染色液 结晶紫 1g 95%乙醇 20mL 1%草酸铵水溶液 80mL
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 2.1.2 革兰氏碘液 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300mL
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
2.1.3 沙黄复染液
沙黄 0.25g 95%乙醇 10mL 蒸馏水 90mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 2.1.4 染色法
2.1.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。 2.1.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
2.1.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇 滴满整个涂片，脱色10s。
2.1.4.4 水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。 2.1.5 结果
革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。
注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。 2.2 吉氏染色法 （可按成品试剂上的说明操作）
吉氏粉 0.5g 中性甘油 25mL 甲醇 25mL
将染粉加少量甘油研磨，边研边加，至甘油加完为止，倾入100mL玻塞瓶内，加入甘油，塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温下3～5天，即为原液，临用时稀释。
2.2.4 染色法
2.2.4.1将血片用甲醇固定约1 min。
2.2.4.2滴加10%染液染45 min。水洗，待干，镜检。 2.3 硼砂美蓝染色法
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玉环县疾病预防控制中心作业指导书 标题：试剂配制 2.3.1硼砂 3g 2.3.2美蓝 2g
文件编号：YJKZ/ZYW6-001 版号：第 2 版，共 26 页 第 2 页 置研钵内,边研边加水,待溶解后冲入瓶中,加蒸馏水100mL配成原液,过滤后备用.染色时取原液5mL，加清水配成稀释液。
2.3.3 染色法
血片染3～5 min，使血膜呈天蓝色，水洗，待干，镜检。
2.4 耐酸性染色法(萎－倪二氏法) （可按成品试剂上的说明操作） 2.4.1 石炭酸品红染色液 碱性品红 0.3g 95%乙醇 10mL 5%酚水溶液 90mL
将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。 2.4.2 3%盐酸－乙醇 浓盐酸 3mL 95%乙醇 97mL 2.4.3 复染液 吕氏碱性美蓝染色液。 2.4.4 染色法
2.4.4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。 2.4.4.2 滴加盐酸－乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1～3min)，水洗。
2.4.4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染30s～1min，水洗，待干，镜检。 2.4.5 结果：耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。 3 生化试验培养基和试剂
3.1 生理盐水
氯化钠 8.5g 蒸馏水 1000mL 溶解后，分装121℃高压灭菌20min。 3.2 磷酸盐缓冲液 3.2.1 储存液
磷酸二氢钾 34g 1mol/L氢氧化钠溶液 175mL 蒸馏水 825mL 3.2.2 制法
先将磷酸盐溶解于500mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH7.2后，再用蒸馏 水稀释至1000mL。
3.2.3 稀释液：取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL。分装每瓶100mL或每管10mL，121℃高压灭菌15min。 3.3 75%乙醇
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玉环县疾病预防控制中心作业指导书 标题：试剂配制 95%乙醇 790mL 蒸馏水 210mL 混匀后备用。
文件编号：YJKZ/ZYW6-001 版号：第 2 版，共 26 页 第 3 页 3.4 蛋白胨水(靛基质试验用) （可用微量发酵管） 3.4.1 成分
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL pH7.4 3.4.2 制法
按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。 3.4.3 靛基质试剂（可按成品试剂上的说明操作）
3.4.3.1 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入 浓盐酸25mL。
3.4.3.2 欧－波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加 入浓盐酸20mL。
3.4.4 试验方法
挑取小量培养物接种，在36±1℃培养1～2d，必要时可培养4～5d。加入柯凡克试剂 约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧－波试剂约0.5mL，沿管壁流下， 覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
3. 5 尿素琼脂（可用微量发酵管） 3.5.1 成分
蛋白胨 1g 氯化钠 5g 葡萄糖 1g 磷酸二氢钾 2g 0.4%酚红溶液 3mL 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 20%尿素溶液 100mL pH7.2±0.1 3.5.2制法
将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121℃ 高压灭菌15min。冷至50～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.2±0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。 3.5.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
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玉环县疾病预防控制中心作业指导书 标题：试剂配制 文件编号：YJKZ/ZYW6-001 版号：第 2 版，共 26 页 第 4 页 3.6 氰化钾(KCN)培养基（可按成品试剂上的说明操作或者用微量发酵管） 3.6.1 成分
蛋白胨 10g 氯化钠 5g 磷酸二氢钾 0.225g 磷酸氢二钠 5.64g 蒸馏水 1000mL 0.5%氰化钾溶液 20mL pH7.6 3.6.2 制法
将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为1∶10000)，分装于12mm×100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在4℃冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。 3.6.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36±1℃培养1～2d，观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2d细菌不生长为阴性(抑制)。
注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。 3.7 氨基酸脱羧酶试验培养基（可用微量发酵管） 3.7.1 成分
蛋白胨 5g 酵母浸膏 3g 葡萄糖 1g 蒸馏水 1000mL 1.6%滇甲酚紫－乙醇溶液 1mL
L－氨基酸或DL－氨基酸 0.5或1g/100mL pH6.8 3.7.2 制法
除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L－氨基酸按0.5%加入，DL－氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。 3.7.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36±1℃培养18～24h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。
3.8 糖发酵管（可用微量发酵管）
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玉环县疾病预防控制中心作业指导书 标题：试剂配制 3.8.1 成分
牛肉膏 5g 蛋白胨 10g 氯化钠 3g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2g
文件编号：YJKZ/ZYW6-001 版号：第 2 版，共 26 页 第 5 页 0.2%滇麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH7.4 3.8.2 制法
3.8.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。
3.8.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
3.8.3 试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36±1℃培养，一般观察2～3d。迟缓反应需观察14～30d。
3.9 ONPG培养基（可用微量发酵管） 3.9.1 成分
邻硝基酚β－D-半乳糖昔(ONPG) 60mg (O－Nitrophenyl－β－D－galactopyranoside) 0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10mL 1%蛋白胨水(PH7.5) 30mL 3.9.2 制法
将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×75mm试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。 3.9.3 试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于36±1℃培养1～3h和24h观察结果。如果β－半乳糖苷酶产生，则于1～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。 3.10 丙二酸钠培养基（可用微量发酵管） 3.10.1 成分
酵母浸膏 1g 硫酸铵 2g 磷酸氢二钾 0.6g 磷酸二氢钾 0.4g 氯化钠 2g 丙二酸钠 3g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH6.8
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