高效液相色谱法测定制剂中维生素D3粉的含量
摘要 用高效液相色谱法测定VD3粉中VD3的含量。采用菲罗门氨基键合硅胶柱（250mm×4.6mm，5μm），以正己烷-异丙醇（99：1）为流动相，流速为
1.5ml/min，检测波长为265nm，柱温为25℃。在此色谱条件下，维生素D3浓度在18.86μg/ml时进样量在10μl～100μl范围内呈良好的线性关系，r=1.0000，平均回收率为99.46%，RSD（n=6）为0.90%。结论：本方法操作简便易行，系统使用性良好，适用于VD3粉中VD3的含量测定。
关键词：维生素D3粉；维生素D3；复方制剂；高效液相色谱法
维生素D3（胆钙化醇；英文名：Vitamin D3）是一种脂溶性维生素，被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，帮助肠道内钙和磷的吸收，促进骨钙沉积，增加肾脏对钙、磷的重吸收，提高血钙、磷的浓度，有利于骨的矿化作用。上市的补钙和补维生素的复方制剂中大多都含有VD3，由于VD3在复方制剂中含量极低，对光、热不稳定，在空气中易氧化和光解成前维生素D3、反式维生素D3、光甾醇和速甾醇等多种产物，在品种开发时多选取制成包合物的VD3粉为原料，以便提高产品的稳定性。
DSM生产的VD3粉加入维生素E、大豆油、明胶制成包合物的形式提高了稳定性。但包合物的形式造成测定时VD3提取难度增大，有文献报到采用皂化后提取测定，此方法操作繁琐，而且提取中有损失影响结果。另有采用稀释剂
（DMSO-水10：2，0.2%BHT）溶解后，正己烷提取浓缩的方法，以达到液相测定浓度的要求，此方法操作时间长，提取浓缩过程中人为误差较大。维生素D3粉进口注册标准JX2008006[7]中提取采用的是回流、萃取、旋蒸、充氮、溶解等方法，操作时间长、操作步骤繁琐，误差大。本文参考相关文献[1] [2] [3] [8]并经验证，证明采用方法准确可靠，且操作简便、快速。 1仪器与试药
高效液相色谱仪（赛默飞U3000、岛津SPD-M20A）；分析天平（奥豪斯AUW120D）；VD3对照品（批号：100061-201208，含量：99.8%，中国食品药品检定研究院）；VD3粉（10万单位/g，瑞士DSM Nutritional Products Ltd）；正己烷、异丙醇和甲醇为色谱纯；二甲基亚砜、二氯甲烷为分析纯。 2方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性
2.1.1色谱条件 用氨基键合硅胶为填充剂（菲罗门 250mm×4.6mm，5μm）：以正己烷-异丙醇（99：1）为流动相，流速为每分钟1.5ml，检测波长为265nm。 2.1.2系统适用性 取VD3对照品溶液，置60℃水浴中加热1 小时，放冷，量取100μl 注入液相色谱仪，VD3 峰和前VD3峰（相对保留时间约为0.5）的分离度应不小于5，理论板数按VD3 峰计算应不低于5000，拖尾因子应不大于2.0。 2.1.3测定方法 避光操作，精密称取适量（约相当于VD3 200μg），置100ml 棕色量瓶中，加溶液【用二甲基亚砜—水（10：2）制成每1ml 中含2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）0.2mg的溶液】50ml，超声振荡15 分钟，并时时振摇，水浴温度不超过30℃，加0.2mg/ml的2，6-二叔丁基对甲酚正己烷溶液25ml，振摇15分钟后，离心，取上层溶液作为供试品溶液，精密量取100μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取VD3 对照品适量，精密称定，用0.2mg/ml的2，6-二叔丁基对甲酚正己烷溶液制成每1ml 中约含8μg的溶液，作为对照品溶液，同法测定，外标法计算，计算结果乘以1.09 即得供试品中VD3含量。
2.2系统适用性试验 称取VD3对照品适量，用0.02%2，6-二叔丁基对甲酚正己烷溶液制成每1ml中约含10μg的溶液。取适量，在60℃水浴中加热1小时，放冷，按2.1的色谱条件操作。结果维生素D3峰和前维生素D3峰的分离度为14；理论板数按VD3峰计算均不低于5000，拖尾因子均小于2，均符合规定。
2.3线性关系试验 取VD3对照品适量，精密称定，用0.2mg/ml的2，6-二叔丁基对甲酚正己烷溶液配制成18.86μg/ml的溶液，精密量取10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、80μl、100μl各注入高效液相色谱仪，在2.1的色谱条件下，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果线性关系良好。
2.4 精密度试验 精密称取VD3对照品9.37mg，置100ml的量瓶中，用
0.2mg/ml的2，6-二叔丁基对甲酚正己烷溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml的量瓶中，用0.2mg/ml的2，6-二叔丁基对甲酚正己烷溶液稀释至刻度，摇匀，按2.1的色谱条件操作，连续进6针，RSD为0.54%。结果表明方法精密度较好。
2.5中间精密度试验 照2.4的配制方法配制溶液，按2.1的色谱条件操作，连续进6针，RSD为0.72%。结果表明方法中间精密度良好。
2.6耐用性试验 通过改变柱温、流速、检测波长和流动相比例等方法进行考察，采用同一对照品及供试品溶液，以测定VD3粉的含量为考察指标，所测得的含量RSD（n=12）小于2%，说明此色谱系统和提取方法用于VD3粉含量测定耐用性较好。
2.7回收率试验 取已测含量的VD3粉（2.53mg/g）约56mg、70mg、85mg各3份，置9个棕色量瓶中，各加定量的VD3对照品，加溶液【用二甲基亚砜—水（10：2）溶液制成每1ml 中含2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）0.2mg的溶液】50ml，超声振荡15分钟，并时时振摇，超声水浴温度不超过30℃，加0.2mg/ml的2，6-二叔丁基对甲酚正己烷溶液25ml，振摇15分钟，离心，取上层溶液作为供试品溶液，取VD3对照品适量，精密称定，用0.2mg/ml的2，6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液制成每1ml约含VD38μg的溶液，作为对照品溶液。各进样100μl进样，按2.1的色谱条件操作，按外标法计算，回收率均在97.68%～100.54%之间，RSD%（n=9）为0.90%，结果表明上述HPLC法测定VD3粉中VD3含量准确度高。
2.8样品测定 维生素D3粉进口注册标准JX2008006[7]中含量测定提取采用的是回流、萃取、旋蒸、充氮、溶解等方法，操作时间长、步骤繁琐，误差大。按2.1的测定方法易操作、误差小。取DSM生产的多批次VD3粉，分别采用维生素D3粉进口注册标准JX2008006[7]和按2.1的测定方法考察，结果表明两种方法所测得的结果基本一致。 3讨论
3.1 检测波长 除EP8.0[4]收载的Cholecalciferol质量标准检测波长为265nm外，《中国药典》[1]、JP[6]、USP[5]收载的VD3质量标准检测波长均为254nm。用95%甲醇水配制一定浓度的VD3溶液和维生素E溶液在200~400nm进行紫外扫描，结果VD3最大吸收波长为265nm，维生素E最大吸收波长为285nm和292nm，故选择265nm作为检测波长。
3.2 折算系数 《中国药典》[1]是测定计算出VD3的校正因子f1和f2，根据公式C= f1A1+ f2A2（其中A1为VD3峰面积；A2为前维生素D3峰面积）计算,过程繁琐，笔者按2.1的测定方法对维生素D3不同浓度进行验证试验，通过公式f1=C1/ A1、f2=（A1- A2）/（A3- A4），其中C1为VD3对照品浓度μg/ml；A1为
对照品（未加热）VD3峰面积；A2为对照品（加热）中VD3峰面积；A3为对照品（加热）中前维生素D3峰面积；A4为对照品溶（未加热）中前维生素D3峰面积。折算系数F=（A5+ f2 A6）/ A5，其中A5为供试品VD3峰面积，A6为供试品中前维生素D3峰面积。最终确定折算系数1.09，并直接参与计算。
3.3提取时间和温度 VD3不稳定，提取时应控制提取时间和提取温度，本文中超声提取时间15分钟，提取温度不超过30℃。
3.4 复方制剂中VD3的含量考察 笔者对Merck Sharp & Dihme Ltd.生产的阿仑膦酸钠维D3片、惠氏生产的碳酸钙维D3元素（4）片和美国安士制药有限公司生产的迪巧按2.1的方法考察，结果表明此方法可用于上述品种中VD3的含量测定，但针对不同品种仍需进行完整的方法学验证。
4总结 DSM生产的VD3粉是由VD3和VE、大豆油、明胶等制成的类白色至淡黄色的易流动的颗粒。测定时为保证含量的准确性，除避光和控制温度，还应做到提取完全、操作简单快捷，本文采用的方法减少了处理过程中VD3的损耗，提高了准确度，回收率高，操作简单。可用于复方制剂中VD3的含量测定，但针对不同品种仍需建立完整的方法学验证，以保证方法的专属性和准确性。 【参考文献】
[1] 《中国药典》[S].2015年版.二部.1241
[2] JX20070088小儿碳酸钙D3颗粒进口注册标准[S] [3] 国家药品标准?新药转正标准[S].第71册，175～176 [4] EP[S].8.0：1785～1787 [5] USP[S].35：2652 [6] JP[S].16:647
[7] JX2008006维生素D3粉进口药品注册标准[S]
[8]周华 高效液相色谱法测定阿仑膦酸钠维生素D3片中维生素D3的含量和有关物质[J] 《亚太传统医药》2012年6月第8卷第6期，51-52。
高效液相色谱法测定制剂中维生素D3粉的含量
