猪胚胎体外培育影响因素的研究综述
摘要： 本研究以孤雌激活胚胎为研究对象，对猪胚胎体外培育进程中的
相关影响因素进行了探讨。体外成熟的猪卵母细胞经孤雌激活后，用添加.05%BSA的NCSU一23培育的囊胚率%)极显著高于添加5%，10%和15üS的NCSU一23%，%和%，P<。在NCSU一23中添加必然比例的TCM一199(10%，25%和50%)，虽然对猪卯母细胞孤雌激活后的割裂率无显著影响%%，%和%，P>，但囊胚发育率随着TCM199比例的增加而显著下降%%，%和%， P<。将NCSU23中的亚牛磺酸浓度从原来的5mmo比降低到.25，或.05mmol几时，对猪卵母细胞激活后的割裂率和囊胚发育率均无显著影响(介.005)，但完全去掉亚牛磺酸则致使囊胚发育率极显著下降%)。在猪卵母细胞激活后的0币oh添加.034mmol几丙酮酸钠和.54mmol几乳酸钠，显著提高卵母细胞的割裂率%%，P<，但60h后在培育液中添加丙酮酸钠和乳酸钠则极显著降低其囊胚发育率，.63，.33%%，<。从胚胎培育开始就添加葡萄糖可提高胚胎的囊胚发育率%%，P<。在NCSU一23中添加12mmoUL的山梨醉，孤雌激活胚胎的囊胚发育率有所提高%%)，但不同不显著(产司.1875)。
以上结果表明:(1)BSA的猪胚胎体外培育效果优于FCS;(2)猪胚胎的体外培育不需要成份复杂的培育液;(3)亚牛磺酸是猪胚胎培育液必不可少的重要成份，但其浓度可下调到现行的1/10;(4)乳酸盐和丙酮酸盐对猪胚胎的初期发育有增进作用，但无益于后期发育;葡萄糖对猪胚胎的整个培育发育进程均有增进作用。(5)山梨醇对猪胚胎的体外发育可能具有增进作用，但其效果有待进一步验证。
关键词: 猪胚胎；体外培育；割裂率；囊胚率
1 前言
人们致力于猪胚胎体外生产的研究至少超过了30年且在不断的进展与进步中[ 1- 3]。长期以来, 大量的研究试图通过改善培育系统来提高体外胚胎生产
效率, 尽力提高整个生产系统各个环节的技术水平[ 2 , 4- 5], 但是进展不大, 目前猪体外成熟 ( I VM ) /体外受精 ( IVF) /体外培育 ( I VC ) 的整体效率仍然较低。卵子的体外成熟和胚胎培育是这一技术的重要环节, 提高这些环节的技术水平对提高整个体外生产体系的效率尤其重要。因此, 本研究拟以猪孤雌激活胚胎为研究对象, 着重探讨猪胚胎体外培育进程的相关影响因素, 以便成立一套有效的猪胚胎体外培育系统。
2 材料与方式
2 .1 试剂及药品
TCM - 199, Gibco公司生产;犊牛血清 ( FCS) ,Hycl one公司生产;人绒毛膜促性腺激素 ( hCG) ,宁波激素制品厂生产。除特别注明外 ,其他所有无机盐和生物化学试剂均为 Sigma公司生产。卵巢保留及运输液:含有 K+、 Ca2 +、 Mg2 +的生理盐水。洗卵液: TCM - 199 + 2%发情牛血清 (OCS)。成熟液: NCSU - 23基础液 + 10%卵泡液 ( PPF) +半胱胺酸 +激素。胚胎培育液: NCSU - 23基础液 +0 . 5%牛血清白蛋白 (BSA)。以上配制的所有试剂均用孔径为 0 . 22μm的微孔滤膜过滤消毒。
2 .2 卵母细胞的收集与成熟培育
从屠宰场搜集青年母猪卵巢 ,将其置于含有30～35 ℃生理盐水的保温瓶内 ,在短时刻内送回实验室;然后用 10 mL注射器和 12号针头穿刺抽吸卵巢上面 3～8 mm卵泡内的卵母细胞 ,在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞层或
部份致密卵丘细胞的卵母细胞 ,用洗卵液清洗 2次 ,放入已装有 1 . 5 mL含有激素 (10 U /mL hCG, 0 . 1μg/mL FSH)的成熟培育液 (无血清的 NCS U - 23基础液 + 10% PFF +10 ng/mL EGF + 0 . 1 mg/mL半胱胺酸 )的玻璃培育皿 (每皿 200～300枚 )中 ,在 38 . 5 ℃、 5% CO二、 饱和湿度的培育箱中体外成熟培育 20～22 h,然后转移到不含激素的成熟液中再培育 22～24 h。
血清的制备
用无菌针头和离心管在发情当天的母牛颈静脉处采血 ,静置 30 min;在 4 ℃冰箱中放置 24 h左右 ,待血清全数析出后 ,以 3 500 r /min离心 10 min;吸取血清 ,再以同一转速离心 10 min;弃去沉淀 ,将血清在56 ℃ 水浴中灭活 30 min;最后将灭活的血清过滤消毒 ,分装 , - 20 ℃ 保留 (使历时掏出解冻 )。
卵泡液的制备
从卵巢表面 3～8 mm的卵泡中抽取卵泡液搜集于离心管中 , 3 500 r /min离心 10 min;弃去沉淀 ,直接用 0 . 22μm的滤器过滤灭菌 ,然后小剂量分装 ,于- 20 ℃ 保留 ,备用。
卵母细胞的激活处置
猪卵母细胞成熟培育 42～46 h后,用吸管反复抽打去掉周围的卵丘细胞,然后在含有 5μmol /L离子霉素( i onomycin)的培育液中处置 5 min (38 . 5 ℃) ,随即用胚胎培育液洗 2次,移入含有 2 mmol /L 6 -二甲氨基嘌呤(6 - DMAP)的培育液中培育 3～4 h (38 . 5 ℃)。
卵母细胞体外培育 ( I VC)及初期胚胎发育潜力的评定
将经人工激活处置后的卵母细胞置于 50μL的培育液微滴中培育 48 h,检查裂情形 ,中间不换液 ,第 6～8天检查囊胚发育情形。
猪胚胎体外培育影响因素的研究
