2型糖尿病大鼠前额叶皮质及海马神经元形态的改变研究
钟泽清，谢丹丹
【摘 要】[摘要] 目的 探讨2型糖尿病大鼠前额叶皮质及海马神经元形态的改变及其意义。方法 利用链脲佐菌素加高脂喂养制作2型糖尿病大鼠模型，利用Golgi-cox染色观察模型大鼠前额叶皮质及海马CA1区神经元树突形态及树突棘密度。结果 与对照组比较，糖尿病组大鼠额叶皮质及海马CA1区神经元出现树突减少，树突棘密度降低。结论 额叶皮质及海马神经元形态的改变是导致糖尿病患者出现神经系统功能障碍的形态学基础。 【期刊名称】现代中西医结合杂志 【年(卷),期】2013(022)006 【总页数】3
【关键词】[关键词] 乙型糖尿病；大鼠；前额叶皮质；海马；神经元
糖尿病是由遗传和环境因素共同作用而引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现得临床综合征，高血糖可以导致视网膜、心脏、微循环血管、周围神经、中枢神经系统功能障碍[1]。这种代谢综合征被认为是产生认知功能障碍甚至痴呆的危险因素[2]，然而糖尿病患者中枢神经系统形态学改变并不清楚。为此，笔者利用Golgi-cox染色方法分析慢性糖尿病大鼠模型前额叶皮质、海马神经元形态的改变，期望发现高血糖对认知功能相关脑区的形态学影响。
1 实验资料
1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠15只，体质量(220±10)g，由湖北医药学院动物中心提供。每笼5只，实验期间均自由进食、水。饲养于自然昼夜照明，室温22～24 ℃，相对湿度50%～80%的动物中心。
1.2 实验试剂 链脲佐菌素粉针剂(streptozocin，STZ，Sigmag公司)；0.1 mol/L柠檬酸溶液、0.1 mol/L柠檬酸钠、重铬酸钾、铬酸钾、氯化汞(太和医院生命科学研究所)，配制pH 4.2的柠檬酸钠缓冲溶液；Golgi-cox溶液的配制[3]：将重铬酸钾、铬酸钾、氯化汞用双蒸水配制成5%溶液，单独储存；浸泡标本前将配制的重铬酸钾、铬酸钾、氯化汞溶液，双蒸水按5∶4∶5∶10混合配制(使用深色玻璃瓶储存，现配现用)。
1.3 造模方法 参考文献[4-5]制作2型糖尿病模型，15只大鼠给予高脂饲料喂养3周后，随机分成模型组10只和对照组5只。造模前1 d禁食12 h，不禁水；将STZ用pH 4.2的柠檬酸钠缓冲溶液配制成浓度为2%的溶液(即配即用)，按25 mg/kg腹腔注射每天1次，连续2 d。对照组给予相同容量的柠檬酸钠缓冲溶液注射。注射2周后，大鼠测空腹血糖(测试前禁食12 h)，以血糖>16.7 mmol/L为模型成功标准，造模成功7只。2组大鼠均高脂饲料喂养2周后取材。
1.4 Golgi-Cox染色方法[6] 大鼠在过量10%水合氯醛腹腔麻醉后，4 ℃生理盐水200 mL、200 mL 4%多聚甲醛心内灌注后断头取脑，以前囟为基准做冠状切面，取前囟前后各4 mm 2个组织块，用Golgi-cox溶液冲洗后，放置在棕色玻璃瓶中，密封，置于37.1 ℃的温箱中48 h。组织取出后用双蒸水冲洗，洗净Golgi-cox溶液，用3%琼脂糖包裹脑组织，放置在振动切片机上(太和医院病理教研室)，做200 μm冠状切片。切片漂浮在双蒸水中。使用漂片法，按下述步骤操作：①双蒸水漂洗2次，每次5 min；②50%乙醇脱水1次，5 min；③浓氨水(25%氨水、双蒸水按3∶1混合)10 min；④双蒸水漂洗2次，每次5 min；⑤5%硫代硫酸钠溶液10 min(避光)；⑥双蒸水漂洗2次，每次5
min；⑦使用70%，80%，95%，100%梯度乙醇脱水，2次，每次5 min；⑧二甲苯透明，中性树脂封片。
1.5 显微镜观察和形态分析[7] 前额叶皮质外锥体层、海马CA1区的辨别依据Paxions-Watson的大鼠解剖图谱；神经元的鉴别依据细胞体形态、尖端树突朝向软膜、大量树突棘。每个切片分析5个神经元，利用Lecia显微镜放大400倍分析。①树突树的观察和分析[8]：用20倍物镜观察神经元，确保将每一个神经元拍摄到一个视野中，分析时采用Ohara和Havton的命名法：从胞体直接伸出的树突分支为一级分支，从一级分支伸出的为二级分支，依次类推。所有树突干用手工描绘，MetaMorph5.0软件测量长度。②树突棘的观察和分析[9]：用40倍物镜观察树突棘，确保显示所有的树突棘。计数神经元所有二级到三级树突的树突棘数目及分支长度，计算100 μm树突干上的树突棘数目。 1.6 统计学处理 数据以表示，采用SPSS 16统计软件进行单因素方差分析。
2 结 果
2.1 2组血糖水平比较 模型组大鼠注射STZ后空腹血糖增高，与对照组比较有显著性差异(P<0.05)，见图1。
2.2 显微形态分析 Golgi-cox染色显示糖尿病可导致大鼠皮质、海马神经元树突棘的丢失，大鼠皮质及海马树突形态见图2～图4。测量结果显示，2组皮质及海马神经元树突的截点数和树突总长比较有显著性差异(P均<0.05),模型组海马CA1区神经元二级树突棘数量与对照组比较明显减少(P<0.05)，见表1。
3 讨 论
人工诱导大鼠糖尿病模型多采用单次大剂量注射STZ的方式制作，STZ对胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用，进而引发实验性糖尿病，单纯以这种方式
2型糖尿病大鼠前额叶皮质及海马神经元形态的改变研究
