荧光素酶标记小鼠结肠癌细胞建立活体成像移植瘤模型

荧光素酶标记小鼠结肠癌细胞建立活体成像移植瘤模型①

罗华灶 李 雪 依 含 谢 君 朱乃硕②

【摘 要】[摘 要] 目的：建立稳定表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞株并构建适用于小动物活体成像系统观察的BALB/c鼠皮下移植瘤模型。方法：通过基因重组的方式，将外源基因插入到逆转录病毒载体上，以工具细胞293T包毒后得到病毒，将携带荧光素酶基因的质粒转染到小鼠结肠癌细胞株CT26中，Puromycin筛选出稳定表达荧光素酶的单克隆细胞株。扩增后接种于BALB/c鼠，建立BALB/c鼠皮下移植瘤模型，通过活体动物成像系统监测肿瘤的生长过程。结果：获得了高水平稳定表达荧光素酶的结肠癌单克隆细胞株，该单克隆细胞株与母细胞系CT26具有相似的生长特性。将稳定表达荧光素酶的克隆接种于BALB/c鼠皮下可成瘤，小动物活体成像系统能准确监测肿瘤细胞在体内的生长过程。结论：成功建立了稳定表达荧光素酶的结肠癌单克隆细胞株。采用活体动物成像系统构建的BALB/c鼠皮下结肠癌移植瘤模型是拓展肿瘤体内生长、转移及治疗相关研究的理想模型。 【期刊名称】《中国免疫学杂志》 【年(卷),期】2019(035)017 【总页数】6

【关键词】[关键词] 荧光素酶；CT26细胞；移植瘤；活体成像；BALB/c鼠 ①本文受国家自然科学基金面上项目(81472843)和上海市科学技术委员会上海市科研计划项目(14ZR1424700)资助。

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，发病率目前全球排名第四，死亡率高居第五位[1]。预计2030年，CRC病例将增加60%，

新病例达到220万，死亡人数达110万[2]。其主要治疗方式为手术，但恶性程度高，术后易复发转移，近年来兴起的免疫疗法正掀起肿瘤治疗的革命[3,4]。小鼠由于与人类存在可比较的基因组大小，繁殖周期短，产仔数大，实验成本低且易于操作[5]，因此小鼠模型仍然是药物发现和新兴疗法的临床前评估的主要支柱[6,7]。开发用于研究的肿瘤异种移植动物模型的主要目的是联系基础和临床研究，也是对体外模型系统运用的很好补充[8]。结肠癌动物模型的建立是研究结肠癌体内发生、进展、侵袭转移及免疫治疗PD-L1抗肿瘤药物效果评估的重要手段[9]。尽管已有学者利用生物发光成像技术建立肿瘤移植模型，但诸多小鼠肿瘤模型尚缺乏动态连续追踪及量化分析[10]。理想的小鼠模型将一致地模拟人CRC的进展，应该在整个结肠和直肠中自发发展，在潜伏期短的动物中具有高发病率，遵循相同的转移模式，在具有免疫能力的动物中发生转移，允许无创监测疾病进展并具有相同的人类疾病分子特征[10]。目前的动物模型不能满足所有这些要求，但随着先进的成像模式，许多细胞系和先进的转基因建模方法可供选择。慢病毒可将目的外源基因整合进靶细胞基因组，实现靶细胞长期而稳定表达目的基因[11,12]，因此本研究采用三质粒慢病毒系统建立稳定整合及表达萤火虫荧光素酶基因的结肠癌细胞株，进行体外生长特性和PD-L1表达量的分析，并进行BALB/c鼠皮下移植瘤模型的构建，运用活体成像系统进行整体动态观察，从而为研究结肠癌的发生、进展机制及判断药物治疗效果提供全新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及环境 CT26细胞和293T细胞购自上海中科院细胞库。

BALB/c雌性小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，体重15～20 g，鼠龄 5～8周，饲养在复旦大学生命科学学院动物房平台SPF环境，按实验动物使用的“3R”原则给予动物人道的关怀。

1.1.2 试剂与设备 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素和PBS购于Thermo公司；LipoFiterTM试剂购自汉恒生物；Polybrene、TritonTM X-100及PI染液购于Sigma；Puromycin购于Gibco；TransDetect Single-luciferase(Firefly)Reporter Assay Kit购于全式金；Luciferase Assay System，Luciferin(In vivo Grade)购自Promega公司；戊巴比妥钠购于德国默克公司；CCK-8试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；BV421 Rat Anti-Mouse CD274(PD-L1)，BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control，BD FACS Stain Buffer(FBS)购自BD；流式细胞仪Beckman Gallios 3L 10C，细胞计数仪Z2 coulter购自美国Beckman Coulter公司；Calibur流式细胞仪购自BD Pharmingen公司。倒置荧光显微镜购于德国Carl Zeiss公司；荧光素酶检测系统(GLOMAX 96 micro plate luminometer)购于Promega公司；活体成像系统(Night OWLⅡ LB983 NC100)购于德国Berthold公司。 1.2 方法

1.2.1 慢病毒的生产 转染前1 d将布满培养皿50%以上的293T细胞接种于24孔板中，转染时将完全培养基换成无血清培养基。将3质粒(psPAX2，pMD2.G以及pHBLVTM)与LipoFiterTM试剂按1∶1体积比混匀后加入293T细胞中，培养6～12 h，去除含LipoFiterTM-DNA的无血清培养基，并换完全培养基继续培养48～72 h，超速离心后取病毒上清，0.45 μm滤膜过滤，收集慢病毒原液，-80℃保存。