His-Tag表达蛋白纯化

His-Tag 表达蛋白纯化原理、方法和问题分析（转） 组氨酸标签蛋白的

纯化

His-Tag 融合蛋白 是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是 表达方便而且基本不影响蛋白的活性， 无论是表达的蛋白是可溶性的或 者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（ IMAC ）纯化。

2． 1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography) 是 Porat h et al.1975 年用固定 IDA 作为配基的填料螯合过渡金属铜、 镍、钴或 锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，

1987 年 Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离 子的 IDA-sephadex G-25 作用力更强，此前在 1986 年他和他的合作 者用 Ni2+-IDA-sephadex G-25 亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的 胰岛素原。同年 1987 年 Hochuli et al. 发现带有相连组氨酸的多肽和 N i2+-NTA 填料作用力更强于普通的肽， 1988 年他第一次用这样的方法 纯化了带六个组氨酸标签的多肽， 无论是在天然还是变性条件下一次亲 和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合 IMAC

变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达 带六个组氨酸标签的蛋白配合 IMAC 纯化变成最常用而且最有效的研究

蛋白结构和功能的有力手段。 1986 年 Porath et al. 还发现 Fe3+-IDA- sephadex G-25 可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现 Ga3+-IDA 也 有同样的效果， 这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽 的富集和纯化，同时 IMAC 也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽， 应用非常广泛。

市面常见的商品化 IMAC 用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几 种：

2.2 影响 IMAC 纯化结果的因素：

2.2.1 填料的种类： 不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支 持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填 料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化， 载量高和特异性好本身 就是矛盾。

2.2.2 填料的配基种类、密度、金属离子种类 填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子， 哪家产品的颜色越深就意 味着和蛋白的作用力越强，适用范

围越广，载量也越高，纯化的好坏关 键看纯化的条件， 仅有填料的特异性是不够的， 同样配基密度下 IDA 填 料的亲和力要比 NTA 的强， 所以 NTA 上不能吸附的样品可以选择 IDA 为配基的填料。

螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴离子的弱。 因此如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钴离子， 它还有一个优点是不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。 相同金属 离子，IDA的强于NTA。螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。

同时镍离子是最常用的， 如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的 效果，因为不同的金属离子有不同的选择性。 因此要希望填料应用范围 广就选择镍琼脂糖凝胶，如果是希望特异性好而且稳定就选择镍 NTA 琼脂糖凝胶 .

2.2.2 蛋白本身的结构和样品来源

IMAC 原理已经说明只要是带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白都 可以被吸附，所以要想得到好的纯化效果，必须选择好纯化的条件，通 常带组氨酸蛋白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍 NTA 琼脂糖 凝胶吸附，但是如果标签折叠在蛋白内部不容易暴露，这样就难纯化， 如果镍琼脂糖凝胶都不能吸附， 可以在样品和平衡缓冲液中加 1-2M 脲， 这样蛋白结构相对松散， 也许能吸附而蛋白不会变性， 对于本身就是变 性的蛋白如果 8M 脲不能吸附，改用 6M 盐酸胍溶解样品就可以被吸附， 因为盐酸胍可以打开脲打不开的结构使得标签能暴露。 当然如果有二硫 键最好加 1-2mMDTT 也可以更好解决吸附的问题。此外也可以把标签 换到另外一端。

2.2.3 缓冲体系， pH 及盐浓度 对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如 Tri s-HCl 等，适当提高缓冲液 pH 可以增加吸附效果，同样原理可以降低

pH 洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓 冲液中需要加 0.1-1M 氯化钠，而在平衡缓冲液添加 00.1-0.5% 吐温或 者 triton 可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。

2.2.4 表面活性剂及其他添加剂 添加一些表面活性剂可以增加蛋白的溶解度， 降低疏水相互作用， 这样

使纯化的结果更好，在实验表明在平衡缓冲液中加 0.5-1% 的吐温可以 使电泳的背景更清晰，杂带减少。对一些难溶解的样品也可以加乙醇或 者甘油。在变性条件下有时会在样品中添加还原剂如巯基乙醇或者二巯 基苏木糖醇， 它们如果浓度过高或者上样量过大， 会导致镍离子还原甚 至脱落，使填料失效，如果要在这样的环境下，那最好选择螯合价位高 的填料如镍 NTA 琼脂糖凝胶或降低还原剂的浓度， 通常 1-2mM 是没问 题的。如果一定要选择高浓度的还原剂，也可以把镍离子还成钴离子， 它不怕还原，把普通的镍琼脂糖凝胶还成钴离子即可。

以下是破碎及提取、纯化操作和常见问题解决方法：

破碎方法 样品的处理对纯化是很重要的， 重要的原则是破碎要温和， 不能使蛋 白断裂或者降解， 否则一些片段同样也带有标签， 这样增加了纯化的 难度。需要注意的问题是超声破碎温度，强度，时间 大肠杆菌的破碎方法：

1) 收集培养发酵液， 4 度 7000-8000g 离心 10 分钟，收集沉淀的 菌体(如果不是马上破碎可以放 -70 度冷冻，但是最好能保存成小块或 者薄片，这样好用。 ) 2) 取 1-2 克菌体加 10ml 破碎缓冲液( pH7.4 的 50mM 磷酸缓冲液 含 0.5M NaCl ，0.5mg/ml 溶菌酶， 1mM PMSF ，1mM MgCl2 ，1. 7units/ml Benzonase, 其中的菌酶， 1mM PMSF ，1.7units/ml Benz onase 现加)在冰上混合 45 分钟， 如果 pH 不在 7-8，需要用 0.5M NaOH 一边搅拌一边滴加 .如果溶菌酶 10mg/ml 混合时间可以缩短到 10 分钟 .

3) 把混合菌体在冰水中用超声探头破碎 20 秒种,总共四次 ,中间间