体外大量扩增原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞及其生物学特
性的初步分析
秦鹏，柴晓菲，王昭月，买玲，高全立 【摘 要】【摘要】
【期刊名称】中国医药生物技术 【年(卷),期】2016(011)004 【总页数】5
【关键词】【关键词】肿瘤浸润淋巴细胞；干扰素 γ；程序性细胞死亡受体 1；原发性肝癌
【文献来源】
https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_chinese-medicinal-
biotechnology_thesis/0201223594852.html
·论著·
目的 探讨体外大量培养扩增原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的新方法，并初步研究其分子表型和功能特征。方法 20 例手术切除的原发性肝癌组织经混合消化酶消化为单个细胞后，应用密度梯度离心法分离其中的淋巴细胞，然后应用两步培养法大量扩增 TILs，并检测它们的生长扩增速度。应用流式细胞仪检测扩增淋巴细胞的分子表型，ELISA 法检测其 IFN-γ 的分泌水平，并分析高表达 PD-1和低表达 PD-1 分子 TILs 分泌 IFN-γ 的能力。
结果 18 例标本中的 TILs 在体外经两步法培养后可以扩增达到 1010数量级。扩增的 TILs 中 CD3+细胞的比例为（91.7 ± 7.4）%，CD3+CD56+细胞的比例为（28.5 ± 11.7）%，CD3+CD4+细胞的比例为（32.5 ± 19.6）%，CD3+CD8+细胞的比例为（62.5 ± 29.1）%。PD-1 分子在 CD3+CD8+细胞
的比例为（23.5 ± 16.1）%。扩增的 TILs 分泌 INF-γ 的水平为（827.8 ± 307.7）pg/ml，其中 9 例 PD-1 分子低表达的 CD3+CD8+细胞的分泌 INF-γ 的水平为（1087.5 ± 249.6）pg/ml，6 例 PD-1 分子高表达的 CD3+CD8+细胞的分泌 INF-γ 的水平为（478.6 ± 69.3）pg/ml，两者相比有明显差异（P ＜ 0.05）。
结论 应用两步培养法从原发性肝癌中大量扩增 TILs 简便易行，扩增的 TILs 主要为 CD3+CD8+T 淋巴细胞，且TILs 中 PD-1 的表达与其分泌 IFN-γ 的能力呈负相关。
www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术， 2016， 11（4）：324-328
原发性肝癌是在亚洲发病率很高的恶性肿瘤，我国肝癌发病率和死亡率是世界上最高的，占全球每年新发病例和死亡人数的 55%［1］。由于原发性肝癌起病隐匿，确诊时多已属中晚期，且患者对放疗和化疗均不敏感，因此治疗效果较差［2］。临床中发现个别肝癌患者单独应用免疫治疗后巨大肿块消失并能获得长期存活［3］，提示部分肝癌对免疫治疗敏感。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）具有较强的特异性杀伤肿瘤细胞的能力，Klapper 等［4］首先在培养体系中应用大剂量 IL-2 将恶性黑色素瘤组织的TILs 扩增到一定数量，然后经 CD3 单抗和同种异体外周血单个核细胞刺激，将恶性黑色素瘤的TILs 扩增到 1010数量级，用于治疗进展期恶性黑色素瘤取得了超过 70% 的有效率。肝肿瘤微环境内往往浸润有大量的淋巴细胞，如能将它们扩增后回输，可能对肝癌有较好的治疗作用。本课题探讨应用两步法体外大量扩增肝癌 TILs，初步分析其分子表型和功能，为应用 TILs 治疗肝癌提供实验和技术基础。
1 材料和方法
1.1 材料
20 例肝癌样本均为河南省肿瘤医院肝胆外科2009 年 11 月 - 2010 年 9 月手术切除所得，均经病理证实为肝细胞性肝癌。患者中男 13 例，女7 例，年龄 34 ～ 62 岁，平均年龄 46 岁。均在肿瘤中心取材，大小约为 2 cm × 2 cm × 2 cm；RPMI 1640 培养基为美国 Gibcobrl 公司产品；混合胶原酶（I，II，IV）、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶均购自美国 Sigma 公司；人 AB 血浆购自河南省中心血站；健康供者外周血单个核细胞由河南省中心血站惠赠；重组人白介素-2 购自北京四环生物制药有限公司；淋巴细胞分离液为中科院生物工程研究所产品；CD3、CD4、CD8、CD56、PD-1 以及 IgG1同型对照和 ELISA 检测 IFN-γ 试剂盒均购自美国 BD 公司。 1.2 方法
1.2.1 TILs 细胞的分离 将手术切除的肿瘤组织立即在无菌条件下去除肿瘤表面坏死组织和结缔组织，用 RPMI 1640 漂洗并剪成约 0.5 mm × 0.5 mm × 1 mm 的小块，种瓶并用混合胶原酶（I，II，IV）、透明质酸酶和 DNA 酶 I 混合消化，37 ℃消化 3 ～ 4 h 后肿瘤组织被消化为单个核细胞，过滤并离心清洗。重新混悬离心后的沉淀并将等体积的 100% 和 75% 的淋巴细胞分离液先后置于离心管中，然后将细胞悬液慢慢加至最上层，非连续密度梯度离心 20 min（2000 r/min），收取下层界面的淋巴细胞。
1.2.2 TILs 细胞的培养和扩增 应用两步法扩增分离的 TILs。首先将分离出的 TILs 细胞悬浮于含有大剂量 IL-2（6000 U/ml）和 10% 人 AB 血清的 RPMI 1640 的培养基内，置于 37 ℃、5% CO2的培养箱内培养。每 3 ～ 5 天换液 1 次。当细胞总数生长至约 1 × 107个时，将其转入含有 30 ng/ml OKT3 和
体外大量扩增原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞及其生物学特性的初步分析
