肇慧君 等
3.4. LAMP引物组合物的特异性试验
提取IPNV (传染性胰脏坏死病毒)、IHNV (传染性造血器官坏死病毒)、SVCV (鲤春病毒)、VHSV (病毒性出血性败血症病毒)和ISA (传染性鲑鱼贫血症病毒)的RNA作为模板进行RT-LAMP反应，进行RT-LAMP特异性试验，结果表明，该LAMP引物组合物只对IPNV进行了特异性的扩增，与其他病毒无交叉反应，结果见图4。
M：Maker DL2000；1：IPNV；2：IHNV；3：SVCV；4：VHSV；5：ISA；6：Negative control。
Figure 4. Specificity for detection of IPNV by RT-LAMP 图4. IPNV RT-LAMP 检测的特异性试验
3.5. LAMP引物组合物的灵敏度试验
利用本研究中得到的最佳反应条件对人工感染带有典型病症的病鱼样品提取的RNA进行扩增，10倍稀释RNA进行RT-LAMP灵敏性试验，检测结果如图5所示，随着模板RNA浓度的降低，特征性条带的亮度也减弱，检测结果为阳性的最大稀释度为10?8，相应的灵敏度为0.01 pg RNA。
M：Marker DL2000；1：10；2：10；3：10；4：10；5：10；6：10?5；7：10?8；8：10?9。
0
?1
?2
?3
?4
Figure 5. Sensitivity for detection of IPNV by RT-LAMP 图5. IPNV RT-LAMP的灵敏度试验
3.6. 样本检测
收集沈阳、本溪、丹东、朝阳、葫芦岛、东港等地区的60份样品，同时采用RT-LAMP方法和常规的PCR方法进行检测。检测结果见表3。结果表明：11份样品采用RT-LAMP方法和PCR方法检测均为阳性；47份样品均为阴性；1份样品PCR检测为阳性，RT-LAMP检测为阴性；1份样品经PCR检测为阴性，经RT-LAMP方法检测为阳性。由此可计算出：本研究建立的RT-LAMP方法灵敏度为：11/(11 + 1) × 100% =
DOI: 10.12677/ojfr.2020.72014
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水产研究
肇慧君 等
91.67%，特异性为：47/(47 + 1) × 100% = 97.92%，与常规PCR方法的符合率为：(11 + 47)/60 × 100% = 96.67%。这些数据表明，IPNV RT-LAMP方法具备良好的特异性和敏感性，适用于传染性胰脏坏死病毒的检测及疫病诊断。
Table 3. Results of clinical samples 表3. 临床样本检测结果
阳性
RT-LAMP方法
阴性 总数
RT-PCR方法
阳性 11 1 12
阴性 1 47 48
总数 12 48 60
4. 讨论与结论
本研究建立的针对IPNV的RT-LAMP检测技术，经试验结果显示，IPNV RT-LAMP特异性良好，与IHNV (传染性造血器官坏死病毒)、SVCV (鲤春病毒)、VHSV (病毒性出血性败血症病毒)和ISA (传染性鲑鱼贫血症病毒)均无交叉反应，只与目标病原IPNV (传染性胰脏坏死病毒)有扩增反应；灵敏度试验显示，IPNV RT-LAMP技术检出低限为0.01 pg IPNV RNA，具备较高的灵敏性，适用于水生动物疫病传染性胰脏坏死病的检测与监测。
在LAMP反应体系中，包括模板在内的各反应组分浓度都应该维持在一定合理范围内，进而保持整个反应体系的平衡。如果模板浓度过高，其LAMP反应的其他原料(包括Bst DNA聚合酶，反转录酶，2×反应缓冲液(RM)，正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP及反向内引物BIP)分配于每块模板(RNA模板)的量相对就低很多，有时候甚至要很多模板去竞争一份原料。当进行LAMP反应时，就会很容易出现非特异性扩增，从而出现假阳性结果。灵敏性试验表明，应用LAMP技术可检测出IPNV RNA在1.0 μg的模板含量。由于水生动物疫病病原感染特点，水生动物病毒在宿主中的含量不会很高，本研究建立的RT-LAMP方法的1.0 μg IPNV RNA模板含量已经超出了实际样品中IPNV的感染量，所以，利用本LAMP方法，无需对待检样品的RNA浓度进行调整，样品RNA提取后，直接进行LAMP反应即可，既提高了反应效率，又加快了反应速度，更适合现场及野外样品的检测，符合了LAMP技术本身具备的反应快速简便的特点，检测结果可通过颜色变化即可做出判断，本研究建立的IPNV RT-LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便、易于判断的特点，适用于基层单位及野外现场快速检测，为传染性胰脏坏死病毒的检测与诊断增添了重要的技术手段。
基金项目
辽宁省自然科学基金项目(20180551285)、原国家质检总局科研项目(2015IK165)、(2016IK156)。
参考文献
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https://doi.org/10.1016/S0166-0934(99)00048-8 [4] Cutrin, J.M., Lopez-Vazquez, C., Olveira, J.G., et al. (2005) Isolation in Cell Culture and Detection by PCR-Based
Technology of IPNV-Like Virus from Leucocytes of Carrier Turbot, Scophthalmus maximus (L.). Journal of Fish Diseases, 28, 713-722. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2005.00675.x
DOI: 10.12677/ojfr.2020.72014
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水产研究
传染性胰脏坏死病毒等温扩增快速检测技术的建立与应用
