高效液相色谱法标准操作规程
题 目 高效液相色谱法标准操作规程 制定人： 日期： 年 月 日 审核人： 日期： 年 月 日 批准人： 日期： 年 月 日 生效日期： 年 月 日 文件编码：SOP-QC-ZJ-6041-03 制定部门：质量检验中心 颁发部门：质量管理部 分发部门：质量管理部、质量检验中心 变更历史：1.2003年3月制定；2.2005年7月执行《中国药典》2005年版第一次修订；3.2010年10月执行《中国药典》2010年版第二次修订；4.2015年12月执行《中国药典》2015年版第三次修订。 目 的：建立高效液相色谱法标准操作规程，确保高效液相色谱法操作规范化。 适用范围：适用于高效液相色谱法的操作。
责 任 者：质量管理部经理、质量检验中心主任、质量检验员。 内 容：
高效液相色谱法系采用髙压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对 供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带人色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进人检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件髙效液相色谱仪由髙压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为3.9?4.6mm,填充剂粒径为3?lOum。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2um)填充剂的耐超髙压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 (1）色谱柱
反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅 胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作
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反相 色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而 成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60C。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH 值一般应在 2?8之间 。残余硅 羟基巳封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱 可耐受更广泛pH 值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。
(2）检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关 。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。
不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401) 项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。
(3)流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐 。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低
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于5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
正相色谱系统的流动相 常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33% 时，允许改变范围为0.7X?1.3X；当X大于 33% 时，允许改变范围为X—10%?X+10%。
若需使用小粒径(约2um)填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应 作 适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。 2.系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常 包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。
按各品种正文项 下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可 对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
(1}色谱柱的理论板数（n)
用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下，注人供试品溶液或 各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间tR和峰宽（W) 或半高峰宽(Wh/2), 按n=16(tR/W）2或n=5.54(tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。tR、W、Wh/2可用时间或长度计下同），但应取相同单位。
(2)分离度（R）
用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测物质与某一指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法
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降解，通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调整。
无论是定性鉴别还 是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其他色谱峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为：
（2tR2?tR1）1.18（tR2?tR1） R? 或 R? hhW1?W2W12?W22 式中 tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1、W2及W1
h/2
、W2分别为此相邻两峰的峰宽及半峰宽。
h/2
当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数U) 和分离度(R)均以峰宽(W)的计算结果为准。
（3）灵敏度 用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比（S /N)来表示 。通过测定一系列 不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定时，信噪比不小于1 0；定性测定时，信噪比应 不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测 能力。
(4)拖尾因子（T )用于评价色谱峰的对称性。拖尾因子计算公式为：
W0.05
T?2d1 式中W0.05为5%峰高处的峰宽； d1为峰顶点至峰前沿之间的距离。
以峰髙作定量参数时，除另有规定外，T值应在0.95?1.05之间 。
以峰面积作定量参数时，一 般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起 止的判断和峰面积积分的准确性，此时 应在品种正文项下对拖尾因子作出规定。 （5）重复性
用于评价色谱系统连续进样时响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不
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大于2.0%;采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加人规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应 不大于2.0% 。 3.测定法
（1）内标法按品种正文项下的规定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，各精 密量取适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰髙，按下式计算校正因子：
AS（f）? 校正因子
ARCSCR
式中 AS为内标物质的峰面积或峰高； AR为对照品的峰面积或峰高； CS为内标物质的浓度； CR为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量： 含量（Cx）?f?Ax AsCs 式中 AX为供试品的峰面积或峰高； CX为供试品的浓度；
As为内标物质的峰面积或峰高； Cs为内标物质的浓度； f为校正因子。
采用内标法，可避 免因供 试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。
(2)外标法 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供 试品溶液中待测物质的峰面积(或峰高），按下式计算含量：
含量（Cx）?CRAx AR共 7 页 第 5 页
2015版高效液相色谱法标准操作规程12.1
