(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109971751 A(43)申请公布日 2019.07.05
(21)申请号 201910257333.5(22)申请日 2019.04.01
(71)申请人 广西壮族自治区药用植物园
地址 530023 广西壮族自治区南宁市兴宁
区长岗路189号(72)发明人 韦筱媚 胡营 许雄彪 韦坤华
梁莹 郭晓云 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理
事务所(普通合伙) 11369
代理人 靳浩(51)Int.Cl.
C12N 15/10(2006.01)
权利要求书2页 说明书7页 附图2页
CN 109971751 A(54)发明名称
防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法(57)摘要
本发明公开了一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，包括：步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C研磨成细粉；步骤二、向细粉加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇的混合液混合，然后水浴加热，得悬浮液；步骤三、冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；步骤四、向上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；步骤五、将待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃废液；步骤六、向离心柱加入乙醇，离心，弃废液，将离心柱晾干至无乙醇；步骤七、向离心柱加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液。本发明具有防止山银花叶处茸毛堵塞离心柱的有益效果。
CN 109971751 A
权 利 要 求 书
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1.防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，包括：步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C，研磨成细粉；步骤二、向细粉中加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇的混合液，混合至细粉完全悬浮，然后于65℃水浴加热30～45min，在水浴加热期间摇匀，得悬浮液；
其中，CTAB提取缓冲液与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02～0.04g，混合液为体积分数为2％的β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，悬浮液与PVP的体积质量比为100mL:1g，悬浮液与维生素C的体积质量比为100mL:1g；
步骤三、悬浮液冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；步骤四、向步骤三中的上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；步骤五、将步骤四中的待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃掉收集管中的废液；
步骤六、向离心柱内的物质中加入乙醇，离心，弃掉收集管中的废液，将离心柱晾干至无乙醇；
步骤七、向离心柱内的物质中加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液。
2.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤一中干燥的山银花叶片是采用变色硅胶干燥。
3.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤二中研磨的方法具体为：置于液氮中冷却1～2min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨30～40s，再置于液氮中冷却1min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨30s；
混合液在加入至步骤一中的细粉之前，提前预热至65℃。
4.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤二中的CTAB提取缓冲液采用改良CTAB提取缓冲液代替，改良CTAB提取缓冲液的制备方法为：
将pH值为8.0的CTAB，NaCl，Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0的EDTA标准溶液，加入容量瓶，混匀，用超纯水定容至改良CTAB提取缓冲液的终体积，灭菌即得改良CTAB提取缓冲液，其中，CTAB、NaCl、Tris-HCl缓冲液、EDTA标准溶液、改良CTAB提取缓冲液的终体积的质量体积比为1.5g:4.091g:5mL:20mL:50mL。
5.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤三中的氯仿和异戊醇的体积比为24:1，离心速度为10000～13000rpm，离心时间5～6min，混合溶剂与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02～0.04g。
6.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤四中的异丙醇与上清液的体积比为1:1，异丙醇的温度为-20℃。
7.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤五中进行两次离心，第一次离心弃掉收集管中的废液后，进行第二次离心，并弃掉收集管中的废液，两次离心的速度均为10000～11000rpm，离心时间均为30s。
8.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤六的具体方法为：向离心管中加入质量分数为70％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，再次向离心管中加入质量分数为75％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃
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CN109971751A防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法[专利] - 图文
