一步法RT-PCR试剂盒
操作方法
在0.2ml或0.5ml薄壁管中加入下列成份： 总RNA Upper primer Lower primer
0.5~1μg 10~30pmole 10~30pmole 2μl 1μl 5U 5U 10U up to 20μl
10×RT-PCR Buffer
dNTP Mixture（10 mM each） AMV Reverse Transcriptase Taq polymerase RNasin
DEPC- treated water
轻轻混匀，短暂离心。45℃温育30~45min，95℃ 5min终止反应。进入以下30个循环：94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1~3min。最后72℃延伸7min。扩增完毕取5~10μl电泳。
注意事项
1、确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。较纯的RNA样品OD260/OD280比值通常为1.8~2.0，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生物RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1，否则，表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、试剂和溶液必须完全无菌。操作过程始终戴手套以杜绝各种RNA酶的污染。
3、使用AMV、RNasin和Taq polymerase等酶类时，应轻轻混匀尽量避免起泡；分取之前短暂离心，缓慢吸取。酶类制品在实验前才从-20℃中取出，使用完毕立即放回-20℃中保存。
常见问题及参考意见
1、cDNA产量很低，为什么？
可能的原因：(1)RNA模板质量低；(2)对mRNA浓度估计过高；(3)反应体系
中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；(4)反应体积过大，一般不应超过50μl。
2、合成不了长链的cDNA，为什么？
(1) RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、干热或湿热灭菌处理，以杜绝RNase污染。同时，在逆转录反应中加入RNase抑制剂。
(2) 反应条件不合适。通过预实验确定最合适的反应条件，包括酶量、盐浓度、反应温度（37~56℃）及PCR反应条件等。 (3) RNA结构问题。提高逆转录反应温度。
一步法RT-PCR试剂盒
